论文部分内容阅读
目的:探讨小鼠脑部受照后,外泌体中的mi R-7通过靶基因Bcl-2调节肺部细胞自噬的机制,为进一步探讨肿瘤患者行放疗后正常组织产生的可能损伤及损伤防护提供依据。方法:1.免疫组化法、Western Blot法检测肺组织中Cleaved caspase-3、Beclin-1、LC 3B、Bcl-2等相关蛋白的表达。2.实时荧光定量PCR检测小鼠脑组织、肺组织、血液、星形胶质细胞等样本中的mi R-7、m RNA Bcl-2的表达水平。3.构建了含Bcl-2-3’UTR野生型及突变型的报告基因质粒,双荧光素酶活性实验验证Bcl-2是mi R-7的直接靶基因。4.超高速梯度离心法提取细胞培养基中的外泌体。5.Di I染料对外泌体进行染色,并加入到正常星形胶质细胞原代细胞培养基中,共聚焦观察外泌体进入细胞情况。结果:1.小鼠脑部照射后,肺部组织中Beclin-1、LC 3BⅡ/Ⅰ蛋白表达量显著增加Cleaved caspase-3蛋白表达量无显著变化。2.小鼠脑部受照后,肺组织mi R-7表达水平较正常小鼠肺部组织高,mRNA Bcl-2表达水平与mi R-7趋势相反,且肺部组织Bcl-2蛋白表达水平较对照组降低。3.双荧光素酶活性实验发现,mi R-7可显著抑制Bcl-2-3’UTR野生型报告基因质粒的荧光素酶活性而对突变型无显著影响,证实Bcl-2是mi R-7的直接靶基因。4.用照射后星胶细胞分泌的外泌体(rad-exo)处理正常星胶细胞后,其mi R-7表达水平显著高于未照射星胶细胞分泌的外泌体(nc-exo)处理的星胶细胞,m RNA Bcl-2显著降低。同时处理组细胞LC 3BⅡ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平高于对照组,Bcl-2蛋白表达水平则降低。通过尾静脉注射外泌体至小鼠体内,结果发现rad-exo组mi R-7表达水平显著高于nc-exo组,m RNA Bcl-2水平显著降低,LC 3BⅡ/Ⅰ、Beclin-1蛋白则显著性升高。结论:1.Bcl-2是mi R-7的直接靶基因。2.Exosome/mi R-7通过调节Bcl-2介导了脑部受照后肺部出现的远位旁观者效应。