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创伤失血性休克是指由于各种创伤所致血管损伤、实质脏器破裂、骨折等引起机体出血、水肿以及渗出等一系列临床综合征。创伤失血性休克后存在血管低反应性,主要表现为血管对舒、缩血管活性药物不敏感,即反应性显著下降甚至不反应。血管低反应性对休克的治疗和预后有严重的影响,是复苏后血压能否回升、休克最终能否成功救治的重要制约因素之一。相关资料显示,在临床ICU中约有30%-40%的病人死亡与血管低反应性有关。因此,深入阐明休克血管低反应性的发生机制具有重要意义。钙敏感性受体（Calcium-sensing Receptor,CaSR）,是最早由Brown等在牛的甲状旁腺中发现,属于G蛋白偶联受体家族成员,它的主要作用是维持细胞内外的Ca2+稳定。近来研究发现,CaSR在心血管系统中也发挥重要的作用,如参与血管钙化和心肌细胞凋亡的调控。有研究显示,CaSR可通过血管内皮细胞调节血管舒张进而调节血压。但CaSR是否参与创伤失血性休克后血管低反应性的调节、其机制如何,目前尚不清楚。据此,本研究拟采用大鼠创伤失血性休克模型以及原代血管平滑肌细胞（VSMC）,研究CaSR在创伤失血性休克后血管反应性调节中的作用及机制。主要内容包括两部分:○1 CaSR抑制剂Calhex231（Cal）是否通过调节血管反应性发挥对创伤失血性休克大鼠的保护作用;○2 Cal调节创伤失血性休克血管反应性的机制。目的是为进一步阐明血管低反应性的发生机制提供基础,并为寻找失血性休克新的治疗方法提供实验依据。主要实验方法:建立SD大鼠创伤失血性休克模型;用离体张力测定技术检测肠系膜上动脉（SMA）和心肌乳头肌对血管活性药物诱导的收缩反应性;采用微循环显微镜检测肠系膜微动脉（MA）收缩反应性;采用激光共聚焦显微镜检测单个VSMC收缩反应性;采用八通道数据采集分析仪检测血流动力学指标;采用激光散斑血流测定仪检测重要器官（肝、肾）血流量;采用心输出量测定仪检测心输出量;采用细胞收缩记录系统检测单个心肌细胞的收缩功能;采用ELISA试剂盒检测血甲状旁腺素（PTH）水平;采用蛋白免疫印迹（WB）检测CaSR、肌球蛋白轻链（MLC）、磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）、α1肾上腺素受体（α1-AR）及β1肾上腺素受体（β1-AR）的蛋白表达水平;qPCR检测microRNA（miR）相对表达量。研究内容:第一部分CaSR抑制剂Cal对创伤失血性休克大鼠的保护作用及与调节血管反应性的关系1.实验分为6组:正常组、休克组、乳酸林格氏液（LR）复苏组、LR+Cal 0.1mg/kg组、LR+Cal 1mg/kg组以及LR+Cal 5mg/kg组,观察不同剂量Cal对创伤失血性休克大鼠存活情况（存活率和存活时间）和血流动力学指标的影响。2.依据实验结果选择合适的Cal剂量用于后续实验。实验分为4组:正常组、休克组、LR组以及LR+Cal 1mg/kg组,观察Cal对创伤失血性休克大鼠重要器官（肝、肾）血流量的影响;检测Cal对创伤失血性休克大鼠心输出量、心肌乳头肌以及急性分离的心肌细胞的收缩反应性的影响;检测Cal对创伤失血性休克大鼠SMA和MA血管反应性以及急性分离的VSMC收缩反应性的影响。第二部分CaSR抑制剂Cal调节创伤失血性休克大鼠血管反应性与MLC磷酸化、肾上腺素受体及miR的关系1.同上建立大鼠创伤失血性休克模型,收集血样及SMA组织样本,检测血PTH水平,检测SMA组织中CaSR、MLC、p-MLC、α1-AR及β1-AR蛋白表达水平,以及miRs（miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-208a、miR-1）相对表达量。2.采用大鼠原代培养的VSMC,观察Cal和CaSR-siRNA处理对CaSR蛋白表达水平、miRs（miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-208a、miR-1）相对表达量的影响。研究结果:一、Cal通过调节血管反应性发挥对创伤失血性休克大鼠的保护作用1.创伤失血性休克后大鼠在数小时内全部死亡,单纯给予LR复苏仅轻度延长休克大鼠的存活时间,Cal治疗能明显提高休克大鼠的存活率和存活时间。创伤失血性休克后大鼠血流动力学指标(MAP、LVSP以及±Dp/Dtmax)明显降低,LR治疗也只有轻度改善作用,Cal治疗能显著改善上述各项指标,以Cal 1mg/kg的效果最为显著。2.创伤失血性休克后大鼠重要器官（肝、肾）血流量明显降低,LR复苏仅轻度增加血流量,Cal治疗能明显增加肝、肾血流量。创伤失血性休克后大鼠心输出量、心肌乳头肌以及急性分离的心肌细胞收缩反应性均降低,LR复苏即能显著改善上述指标,Cal治疗与单纯LR治疗效果无明显差异。创伤失血性休克引起了严重的血管低反应性,包括SMA、MA以及急性分离的VSMC的收缩反应性均降低,LR治疗仅有轻度改善作用,而Cal治疗能明显改善血管及血管平滑肌细胞的收缩反应性。二、Cal调节创伤失血性休克大鼠血管反应性的机制1.创伤失血性休克后大鼠血PTH水平明显升高,LR治疗后血PTH水平继续升高,给予Cal治疗后血PTH水平降低。休克后SMA组织中p-MLC和α1-AR蛋白表达水平显著降低,Cal处理能增加p-MLC和α1-AR蛋白表达水平,而MLC和β1-AR蛋白表水平达各组无明显变化。2.创伤失血性休克后大鼠SMA中CaSR蛋白表达水平增加,miR-429、miR-208a以及miR-1相对表达量均降低,Cal能明显降低CaSR蛋白表达水平,增加miR-429和miR-208a相对表达量。而miR-200b和miR-200c相对表达量在此过程中无明显变化。在原代培养的VSMC实验中显示了相似的变化趋势,Cal处理以及CaSR-siRNA降低了CaSR蛋白表达水平,并增加了miR-429和miR-208a的相对表达量。结论:1.CaSR在创伤失血性休克后血管反应性调节中有重要作用。休克后大鼠心脏收缩功能和血管收缩反应性均明显降低,单纯LR复苏对心脏收缩功能有明显恢复作用,但无明显改善血管低反应性的作用;Cal对休克后血管低反应性有明显的改善作用,提示Cal能通过改善血管低反应性发挥对创伤失血性休克大鼠的保护作用。2.创伤失血性休克后,Cal可抑制血PTH水平、上调血管α1-AR蛋白表达水平,进而升高MLC磷酸化水平,最终改善创伤失血性休克后的血管低反应性。此外,Cal还可通过下调CaSR表达、调节血管组织和VSMC的miR-429和miR-208a水平,来参与对血管反应性的调节过程。