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研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年痴呆最常见的类型,它是一种以脑内老年斑、神经纤维缠结和神经元缺失为主要病理特征的神经退行性疾病,临床上主要表现为进行性记忆力减退和认知功能障碍。β淀粉样蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分,其由前体蛋白经β-分泌酶和γ-分泌酶分步剪切生成。Aβ在脑区的异常积累被认为是AD发病的关键环节。BACE2是一种条件性β-分泌酶,而TMP21(transmembrane protein,21KD)则调控γ-分泌酶的活性。已有研究证明钙调磷酸酶调节因子1(regulator of calcineurin 1,RCAN1)的最主要亚型(RCAN1.1L)在AD患者脑部表达异常上调,但RCAN1.1L对BACE2和TMP21表达水平的调控作用并不清晰。因此在本论文中,我们将进一步明确RCAN1.1L对BACE2和TMP21表达水平的调控作用及相关机制,为探讨AD的发病机制提供新的见解。研究目的:明确RCAN1调控BACE2和TMP21表达水平的作用及机制研究方法:1.BACE2蛋白的降解途径①用CHX处理瞬时转染BACE2-mycHis质粒的HEK293细胞,以及未经转染的HEK293细胞和原代培养的小鼠皮层神经元,Western Blot检测外源和内源BACE2蛋白的表达水平,明确外源和内源BACE2蛋白的半衰期;②分别用溶酶体抑制剂及蛋白酶体抑制剂处理瞬时转染BACE2-mycHis质粒的HEK293和SH-SY5Y细胞,以及未经转染的HEK293细胞和小鼠原代皮层神经元,Western Blot检测外源和内源BACE2蛋白的表达,明确BACE2的降解途径。2.RCAN1调控BACE2表达水平的作用机制①利用半定量PCR检测HEK293及HRNLM细胞(HEK293中稳转RCAN1.1L-mycHis)中 BACE2 mRNA 水平的差异;②在 HEK293 及 HRNLM 细胞中瞬转BACE2-mycHis质粒,Western Blot检测外源BACE2蛋白水平的差异;③用CHX分别处理瞬转BACE2-mycHis质粒的HEK293和HRNLM细胞,检测外源BACE2半衰期的差异;④用溶酶体抑制剂或蛋白酶体抑制剂处理瞬时转染BACE2-mycHis 质粒的 HEK293 和 HRNLM 细胞,Western Blot 检测 BACE2 蛋白水平变化,明确RCAN1对BACE2降解的调节作用。3.RCAN1对TMP21表达水平的调控作用通过半定量PCR和Western Blot分别检测HEK293和HRNLM细胞中TMP21 mRNA和蛋白水平的变化。研究结果:1.BACE2通过溶酶体途径与蛋白酶体途径降解①外源BACE2蛋白在HEK293细胞中的半衰期大约为6h,内源BACE2蛋白在HEK293细胞和原代皮层神经元中的半衰期大约为4h;②在不同类型的细胞中,外源性及内源性BACE2都通过溶酶体和蛋白酶体双途径降解。2.RCAN1抑制BACE2的降解①HEK293和HRNLM细胞中内源BACE2的mRNA水平无明显差异;②相对于HEK293细胞,HRNLM细胞中外源BACE2蛋白水平明显上调;③相对于HEK293细胞,HRNLM细胞中BACE2蛋白拥有更长的半衰期;④RCAN1抑制BACE2的蛋白酶体降解途径。3.RCAN1增加TMP21的表达相对于HEK293,HRNLM细胞中TMP21的mRNA和蛋白水平有明显上调。研究结论:1.BACE2蛋白通过溶酶体途径与蛋白酶体途径降解;2.RCAN1抑制蛋白酶体途径介导的BACE2蛋白降解;3.RCAN1通过增加TMP21的转录促进TMP21的表达,但RCAN1对TMP21表达的影响可能不是通过Calcineurin/NFAT途径介导的,具体的机制仍不明确。