课题背景 骨肉瘤为骨科领域内最常见的原发恶性肿瘤，恶性程度高，生存率很低。随着骨肉瘤基础研究的深入和综合治疗的开展，现今治疗骨肉瘤的目标已从单纯手术截肢抢救生命转至同时保留肢体基本功能和延长生命为目的。因此综合治疗中的瘤骨有效灭活成为手术的关键一环，它直接关系到术后复发以及生存率的问题。液氦冷冻外科在骨肿瘤治疗上已逾30余年，达到良好的局部肿瘤控制，而对骨与关节功能影响较小，从而奠定了冷冻外科在骨肿瘤治疗中的地位。我科从1983年开始，采用瘤骨液氮浸泡法，治疗原发性肢体骨恶性肿瘤54例，取得了良好的临床疗效。在临床上积累了丰富的治疗经验，对这项技术的生物安全性有一定的认识。但在微细和超微结构认识上，还存在着许多问题没解决，其中的一个关键问题在于冷冻后的光镜检查，仍能观察到大量的有完整细胞核的肿瘤细胞，这些细胞在体内转归仍不清楚，是否诱发一系列酶解级联反应，是否发生细胞凋亡，这是本 渐江大学学位论文 课题研究的重点。 材料与方法 一 标本采集 2000年3月～2001年12月间，我院经临床、X线、病理确 诊为＊B期骨肉瘤病人共ZI例。男性15例，女性6例，年龄15～25 岁，发病部位股骨下端 15例，腔骨上端 6例，肿瘤直径 4～10cm。 本组实验材料均为骨肉瘤保肢术前的活检组织，患者此术前 均未行化疗，以排除化疗对肿瘤细胞微细和超微结构的影响。 肿瘤组织均采用切开活检，在肿瘤生发层组织中切取Zcm’大 小的标本 3块。一块经 10％的福尔马林固定，准备作 HE染色； 另一块即切成约lmm‘大小数条，立即投入2．5％戊二醛中固定； 最后一块放入金属容器中，汁入液氮浸泡（须完全覆盖组织）， 持续浸泡3分钟，自然复温，反复2－3次，取出组织迅速切成大 小约 lmm’大小数条，投入 2．5％戊二醛中固定。 二 制作石蜡切片 病理标本经 10％的福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切片。 HE染色后病理检查确认。 三 超薄切片制作 经2．5％戊二醛固定后锁酸固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋， 超薄切片，2％醋酸铀和构椽酸铅复染，用 JEM－1200EX透射电镜 观察，放大率4000－8000倍。 结 果 本课题采用光镜和透射电镜观察瘤骨液氮浸泡前后的生发层 2 浙江大学学位论文 瘤细胞细微和超微结构变化。对ZI例化疗前的骨肉瘤活检标本 分别作冷冻前后的光镜、透射电镜形态学观察，光镜发现冷冻后 若干瘤细胞体积变小，形态改变不显著。透射电镜着重对这一部 分瘤细胞观察，发现典型的凋亡现象：细胞体积缩小，染色质浓 缩致密，并沿核膜分布，形成新月体状，细胞膜微绒毛消失，但 胞浆内各种细胞器基本正常，线粒体缩小，核发生碎裂。胞质浓 聚，内质网明显扩张，扩张的内质网与细胞膜融合，在融合处的 细胞膜有火山口样的凹陷，有的形成大囊泡，成为特征性的发泡 现象。质膜也明显卷曲内折，包绕胞质成分和核碎片，便整个细 胞崩解成为一系列大小不等有质膜围绕的致密的凋亡小体。 讨 论 实验中透射电镜观察发现：冷冻除了物理或化学致死模式 外，尚存在细胞凋亡这一生物致死模式。而这种致死模式，显然 在肿瘤治疗中起更重要的作用。分析起来原因可能是本实验中液 氮在较短时问内作用于瘤骨，使其周围细胞在数秒至数小时内发 生胞内结晶，冰晶变大，细胞破裂死亡，而在短时间内又撤除液 氮浸泡，使中心区细胞线粒体内钙离十外流，大量氧自由基的产 生，Bax、Fas、Rb等基因过表达，氧自由基大量产生，从而发生 线粒体跨膜电位，致使线粒体跨膜电位崩解。而线粒体跨膜电位 崩解是细胞凋亡的特异性标志，从而证实液氮浸泡后瘤骨有完整 细胞核的瘤细胞确实发生早期凋亡。 尽管如此，透射电镜形态学观察仍只能是定性，不能定量在 定量观察上，Vermes协冰nnexin V法较 TUNEL法在定量检测方