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甲状腺相关眼病(Thyroid-associated ophthalmopathy,TAO),又称Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO),是一种复杂的自身特异性免疫性疾病,与Graves病(Graves disease,GD)密切相关,是GD最常见、最重要的甲状腺外器官损害。它具有毁容性和潜在的致盲性,最终导致眼眶组织重塑和邻近眼球结构功能的破坏。其确切发病机制尚不清。目前临床上对TAO的治疗尚无特异性的治疗方法。胰岛素样生长因子-1受体(Insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)和促甲状腺激素受体(Thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)是目前研究较为广泛的与TAO相关的两种自身抗原。眼眶成纤维细胞(Orbital fibroblasts,OFs)表达胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R),TSHR抗体免疫沉淀复合物可以有效地作用在IGF-1R,与IGF-1R形成物理和功能信号传导复合物。一些研究表明,抑制IGF-1R活性导致在任一受体处起始的信号传导的减弱。这些实验研究结果作为最近完成的一种靶向作用于TAO中IGF-1R的单克隆抑制性抗体teprotumumab治疗试验的基本原理提供了依据。该单克隆抗体teprotumumab在降低活动性,中度至重度TAO的临床活动评分(Clinical activity score,CAS),突眼和复视方面是有效的,其试验结果令人鼓舞。近年来的的动物模型实验也进一步证实IGF-1R在TAO的发病中起了很关键的作用。miRNA-146a具有多个靶基因,为典型的多功能miRNA,在同一细胞通路中依据不同的条件,而发挥各自特征性的调节作用,参与免疫调控、细胞增殖分化、凋亡、细胞外基质代谢等多种生命过程。前期我们的研究已发现:miRNA-146a在TAO患者眼眶组织及外周血单核细胞(Peripheralblood mononuclear cells,PBMC)中低表达,而在正常人眼眶组织中高表达。另外,IGF-1R是利用TargetScan 6.2进行生物信息学分析揭示的miR-146a的靶标(http://www.targetscan.org,发布日期为2012年6月)。本研究在上述研究背景条件下,对TAO的眼眶成纤维细胞进行相关基础研究。目的:我们将从miRNA这个新视点入手,探索miR-146a对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞形态影响和增殖的调控作用,并且阐明miRNA-146a在眼眶成纤维细胞中对IGF-IR和其下游分子Akt蛋白及相关炎性因子TNF-α的差异性表达,为研究眼眶成纤维细胞在TAO的发病机制中起到一定的奠基作用。探索TAO在基因层面的发病机制,研究针对TAO的靶向治疗药物,为TAO的防治奠定基础。方法:本研究设实验组(TAO,11例)和对照组(Control,8例)两组。对11例接受眼眶减压手术的甲状腺功能亢进性视神经病变患者进行了球后眼眶结缔组织标本的采集作为实验组。选取因眼外伤等原因引起眼球萎缩而需行眼球摘除+义眼座植入术的患者,且与实验组年龄,性别相匹配的8例作为对照组。实验组和对照组患者均无活动性炎症。选取眼眶球后组织用于眼眶成纤维细胞的原代培养来源。根据预实验结果加入合适的含阴性对照组(Negative control,NC),miR-146a mimic(miR-146am),miR-146a-5p-inhibition(miR-146ai)的各组慢病毒,分别加入到实验组和对照组的各个孔。使用荧光显微镜检测感染后的眼眶成纤维细胞的转染效率及形态,用CCK-8分别检测各组细胞的24h,48h,72h,96h的光密度值(optical density,OD),并计算眼眶成纤维细胞的细胞存活率(Cell viability)。我们通过组织提取和原代细胞培养技术,然后传代培养,获得相对纯化的人眼眶成纤维细胞。纯化后的人眼眶成纤维细胞经鉴定后用于后续实验。利用携带目的基因的慢病毒转染人眼眶成纤维细胞,过表达或抑制眼眶成纤维细胞miR-146a的表达水平后,将转染成功后的眼眶成纤维细胞通过激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术分析眼眶成纤维细胞表面IGF-IR受体的定位和表达,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测miR-146a对成功转染后的眼眶成纤维细胞中Akt蛋白表达的影响。最后通过ELISA法检测转染48h后眼眶成纤维细胞上清液中TNF-α的表达水平。结果:体外成功培养人眼眶球后组织原代眼眶成纤维细胞,并进行纯化培养及鉴定眼眶成纤维细胞。然后将携带miR-146 mimic(miR-146a)或miR-146a inhibitor(miR-146ai)目的基因的慢病毒成功转染到眼眶成纤维细胞中。转染后眼眶成纤维细胞感染效率在80%以上,眼眶成纤维细胞形态未见明显变化,仍成长梭形或多角形。CCK-8结果显示转染外源性miR-146am后,TAO组和对照组均能促进眼眶成纤维细胞的增殖,细胞存活率大于1,而miR-146ai则显著抑制眼眶成纤维细胞的增殖,且细胞存活率小于1。经统计学分析,各组差异均有统计学意义(P<0.05)。激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术显示,外源性的miR-146am使甲状腺相关眼病中眼眶成纤维细胞表面的IGF-1R的表达减少,miR-146ai使眼眶成纤维细胞表面的IGF-1R的表达增加,IGF-1R定位于眼眶成纤维细胞核周、胞质及质膜隔室。经统计学分析,差异有统计学意义(P<0.05)。WB结果提示外源性miRNA-146am使甲状腺相关眼病中眼眶成纤维细胞中Akt蛋白的表达减少(P<0.05),差异有统计学意义。ELISA法检测TAO组患者眼眶成纤维细胞48h上清液中TNF-α水平明显升高,结果与正常组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在TAO患者眼眶成纤维细胞中,miR-146am组TNF-α水平下降(P<0.05),同时miR-146ai组水平升高(P<0.05)。在正常人眼眶成纤维细胞,miR-146ai组的TNF-a水平升高(P<0.05),miR-146am组TNF-a水平与Control-NC没有统计学差异(P>0.05)。结论:外源性miR-146am对人眼眶成纤维细胞形态变化无明显影响,而对人OFs的增殖具有明显促进作用。外源性miR-146am抑制甲状腺相关眼病中眼眶成纤维细胞表面的IGF-1R和Akt蛋白的表达,miR-146ai则是促进眼眶成纤维细胞IGF-1R和Akt的表达。该作用说明IGF-1R/Akt可能是TAO发展的重要通路,外源性miR-146am可能通过IGF-1R/Akt通路影响TAO的发展。IGF-1R在TAO眼眶成纤维细胞中表达,IGF-1R是眼眶成纤维细胞的信号传导分子,而Akt分子作为已知的IGF-1R信号通路上重要的下游分子,可能导致透明质酸或者相关炎性因子的变化,可能与TAO的发生发展的有关。研究miR-146a对眼眶成纤维细胞IGF-1R/Akt的影响,可能对抑制TAO局部的细胞增殖和炎症反应有一定作用,但可能有不同的通路,尚需要我们进一步研究。对于了解TAO的发病机制和特异性治疗方法的发展具有重要意义,这可能成为TAO治疗的新途径。此外,外源性miR-146am可抑制眼眶成纤维细胞中TNF-α的表达,同时miR-146ai可促进眼眶成纤维细胞中TNF-α的表达。miR-146a对炎症反应具有积极作用。研究miR-146a对眼眶成纤维细胞的增殖反应、相关信号通路蛋白的表达及炎性反应因子的作用,对于了解TAO的发病机制和特异性治疗方法的发展具有重要意义。