环糊精（Cyclodextrins,CD）作为一类重要的淀粉衍生物,其由环糊精糖基转移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase）作用淀粉生成,在食品、医药、材料、化妆品等领域应用广泛。CGTase不能作用于淀粉中的分支点,限制了环糊精生产过程中淀粉底物的利用率,因此考虑在反应中添加普鲁兰酶以解决此问题。然而环糊精是普鲁兰酶的抑制剂,使得普鲁兰酶在与CGTase协同转化制备环糊精过程中无法有效发挥脱支作用。本论文基于以上问题,考虑通过定点突变的手段改造普鲁兰酶,以减弱环糊精对其的抑制作用。在蛋白质数据银行（Protein Data Bank,PDB）中筛选带有环糊精配体的普鲁兰酶,构建表达载体,重组表达Bacillus subtilis str.168来源的普鲁兰酶PulA,探究PulA与环糊精结合的机制和结构基础,通过定点突变的手段得到环糊精对其抑制作用减弱的普鲁兰酶突变体,并考察突变体的酶活、环糊精对突变体抑制作用的变化、突变对酶结构稳定性和配体结合的影响等酶学性质,最后将有效突变体用于与CGTase同步转化生产环糊精,以考察其应用性质。主要研究内容如下:（1）PulA的重组表达及酶学性质研究:构建带有B.subtilis str.168普鲁兰酶编码基因pul A的分泌型表达载体p ET-20b-pul A,并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中异源表达。对重组菌的发酵液采用硫酸铵沉淀和镍亲和层析两步纯化得到电泳纯的分子量约为83 k Da的普鲁兰酶PulA。酶学性质分析结果表明,PulA具有水解活力和逆水解活力,最适温度和最适p H分别为40℃和p H 6.0,PulA在最适条件下的水解活力为136.1 U/mg。PulA与β-CGTase协同作用马铃薯淀粉、木薯淀粉和玉米淀粉时,对底物利用率和产物转化率的改善很有限。（2）PulA与环糊精之间相互作用研究:α-CD、β-CD和γ-CD对PulA均存在抑制作用,且抑制效果和抑制速率均表现为β-CD>α-CD>γ-CD。对于三种环糊精,抑制效果随环糊精浓度的增加而增强,随底物浓度的增加而降低。抑制动力学结果表明,α-CD、β-CD和γ-CD对PulA的抑制均为竞争性抑制,抑制常数Ki分别为2.25、1.04和5.73m M。等温滴定量热法（ITC）的结果表明,PulA与环糊精结合的主要驱动力是疏水相互作用,对三种环糊精的解离常数KD分别为4.59、3.84和15.30μM。分子对接和晶体结构分析结果表明,PulA中与三种环糊精结合的共性氨基酸残基为W437、D465、R468、F476、H477、N526和E579。（3）打破受体亚位点芳香氨基酸残基对环糊精的束缚结构的研究:PulA中受体亚位点W437和F476在不同来源的普鲁兰酶中是绝对保守的,与环糊精之间的作用力分别为堆积力和疏水相互作用,且W437、环糊精和F476形成稳定的“三明治”结构。基于打破受体亚位点芳香氨基酸残基W437和F476与环糊精的稳定结合,构建并异源表达突变体W437G、W437P、W437R、W437F、F476Y、F476V、F476H、F476C、F476D和F476A。突变体最适温度和最适p H不变,仍为40℃和6.0。酶活测定结果表明,W437的突变使得水解活力基本丧失;圆二色光谱、ITC和分子对接结果显示,W437突变体的二级结构发生显著变化,结构稳定性损失严重,从而失去与配体的结合能力,造成酶活的丧失。对于F476突变体F476Y、F476V、F476H、F476C、F476D和F476A,其酶活均降低,分别为PulA的35.3%、1.6%、32.8%、31.0%、2.7%和7.8%;抑制动力学的结果表明,F476突变体的抑制常数Ki分别为3.9、1.3、4.2、3.5、1.4和1.6 m M,均大于PulA的Ki值,结果表明,环糊精对突变体的抑制作用相对于PulA发生明显降低,其中,突变体F476C和F476H具有较好的表观活力,分别为29.9和35.7 U/mg,均高于PulA的表观活力。ITC的结果表明,突变体F476C和F476H与β-CD的解离常数KD分别为32.1和22.7μM,均大于PulA与β-CD之间的解离常数,进一步表明环糊精对突变体F476C和F476H的抑制作用相对于PulA减弱。最优突变体F476H与β-CGTase联用制备β-CD,与不添加脱支酶相比,其对马铃薯淀粉、木薯淀粉和玉米淀粉的转化率分别提高了20.1%、30.3%和29.0%。（4）非保守性氨基酸残基对环糊精抑制作用的贡献研究:PulA受体亚位点氨基酸残基E579与环糊精之间存在氢键作用,其在不同来源的普鲁兰酶中是不保守的;D465饱和突变体与β-CD的分子对接结果表明,突变体E579A、E579G、E579Q、E579D、E579P、E579C、E579F和E579S与β-CD结合的自由能均大于PulA的-6.9 kcal/mol;因此构建并异源表达以上突变体,测定其酶活分别为18.7、29.5、83.3、61.6、3.9、3.2、24.5和18.2 U/mg,均低于PulA的136.1 U/mg。10 m Mβ-CD对PulA、E579P、E579Q、E579S、E579D、E579F、E579G、E579A和E579G的抑制率分别为85%、6%、36%、78%、72%、26%、12%、89%和85%,除突变体E579A和E579G外,β-CD对其他突变体的抑制作用均降低,但突变体的表观活力低于PulA。圆二色光谱和荧光光谱的结果表明,E579的突变破坏了酶的二级结构和三级结构,结构稳定性的破坏使其酶活降低,说明此位点对维持酶催化结构的稳定性至关重要。（5）保守性氨基酸残基对环糊精抑制作用的贡献研究:PulA受体亚位点氨基酸残基D465与环糊精抑制剂之间存在氢键作用,且在不同来源的普鲁兰酶中是绝对保守的。基于打破氢键束缚构建并异源表达突变体D465E、D465N、D465A、D465G、D465K、D465R和D465I,经过相同的两步纯化可得到电泳纯的分子量约为83 k Da的突变体蛋白,测得的突变体酶活较PulA均降低,分别为89.4、18.3、3.0、2.4、1.5、1.2和1.6U/mg;突变体的最适温度发生轻微变化,最适p H不变,仍为6.0;10 m Mβ-CD对突变体D465E、D465N、D465A、D465G、D465R、D465K和D465I的抑制率由对PulA的85%分别降至68%、66%、49%、40%、3%、21%和1%,说明环糊精对D465突变体的抑制效果降低,其中突变体D465E具有最高的表观活力。抑制动力学结果表明,β-CD对D465E的抑制常数Ki为1.28 m M,低于PulA的1.04 m M,进一步表明环糊精对突变体D465E的抑制作用降低。最优突变体D465E与β-CGTase联用制备β-CD,与不添加脱支酶相比,其对马铃薯淀粉、木薯淀粉和玉米淀粉的转化率分别高了13.6%、22.5%和23.1%。