研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC,以下简称肝癌)是全球最常见的恶性肿瘤之一,世界上每年新诊断的病例约60万例,肝癌引起的死亡位居所有癌症相关死亡的第三位。乙肝病毒慢性感染是肝癌形成的重要因素之一,由于我国有超过1亿的乙肝感染者,所以原发性肝癌更是高发的重大疾病。据卫生部统计,2007年我国城市居民肝癌死亡率占恶性肿瘤死因的第2位(25.47/10万)。在农村居民中,肝癌死亡率甚至达到了28.72/10万。虽然肝癌切除技术日益完善,但许多肝癌患者就诊时病情已进展,导致肝癌可切除率不高、术后复发率居高不下,患者的预后严重受严重影响。因此,肝癌的预防和早期诊断至关重要。目前,临床诊断手段缺乏,早期诊断率低,许多肝癌一经发现己至进展期。尽早发现肝癌的癌前病变是早期诊断和改善预后的关键,但在临床上尚缺乏诊断肝癌前期病变的可靠指标。尽快阐明肝癌癌前病变,从而建立针对这些高危人群的癌症预防战略,是医学工作者的一项迫切任务。肝硬化作为肝癌的癌前期病变,其组织内最大的病理特征改变是胶原纤维的沉积,本实验通过二乙基亚硝胺(DEN)诱癌,模拟动态观察肝硬化肝癌发生过程中肝组织胶原的变化特点,初步探索其中规律,以期为寻找肝癌癌前期特异性病理变化提供参考。目的1.建立改良型伴发肝硬化肝癌大鼠模型,为研究肝癌发病特点和药物干预提供较理想动物模型。2.动态观察大鼠自肝炎、肝硬化发展为肝癌过程中胶原纤维的变化特点,探讨肝癌前期病变的病理特征,为肝癌预防和肝癌预后提供参考。材料和方法1.动物分组和模型制备：50只Wistar大鼠(100-120g)随机分为模型组30只、对照组20只。模型组以二乙基亚硝胺(DEN)腹腔注射,50mg/Kg体重,每周2次,连续4周后改为每周一次腹腔注射DEN,50mg/Kg体重,至14周停止；对照组以生理盐水腹腔注射,0.1ml/次,每周2次,连续4周后改为每周一次腹腔注射生理盐水,0.1ml/1次,至14周停止。于诱癌开始后第2、4、8、12、14、18周,分批处死大鼠,每次处死模型组大鼠3只,对照组大鼠3只。持续乙醚吸入麻醉,心脏取血5ml,制备血清,置-20℃储存。出现癌灶者取肉眼癌灶及距癌灶边缘1cm癌旁组织,大小约0.5cmx0.5cm,用10%中性福尔马林固定,未出现癌灶者,随机取部分肝组织,大小约0.5cm×0.5cm,用10%中性福尔马林固定,用于病理石蜡切片制备。其余组织-80℃冰箱冷冻保存。2.血清生化指标测定：使用Aeroset全自动生化分析仪进行血清谷丙转氨酶、总胆红素、γ-谷氨酰转肽酶检测。3. Western-blot蛋白印迹技术：进行肝组织内基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的测定。4.PCR技术：进行肝组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的检测。5.常规病理检测和特殊染色：对不同时期肝组织切片进行HE、Masson三色、网状染色等。并采用Knodell分级、Ishak分期及Metavir分期对标本进行分级分期。6.荧光免疫染色：检测肝组织内CD31的表达量。7.数据处理：利用SPSS13.0统计软件对各数据进行统计分析。结果1.诱癌14周以后成功诱导出肝硬化伴发的原发性肝癌,14周时成癌情况为3/5,18周时成癌情况为3/3,成癌率为75%,总体死亡率33%(10/30)；2.模型组大鼠体重在诱癌2周以后与对照组相比减轻,且具有统计学意义,p<0.05；3.模型组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)第2周开始升高,第14周达高峰,第18周时下降。第2周以后模型组与对照组间均有统计学差异(p<0.05)；4.模型组大鼠血清总胆红素(TBIL)第4周开始升高,第14周达高峰,第18周时下降。第4周以后(除12周外)模型组与对照组间均有显著性统计学差异(p<0.01)；5.模型组大鼠血清γ-谷氨酰转肽酶随时间逐渐升高,12周以后变化不明显。诱癌第12周以后模型组GGT含量与对照组比较有统计学差异(p<0.05)；6.DEN诱导的伴发肝硬化的大鼠肝癌模型中,肝硬化时,肝组织内胶原沉积明显,窦周胶原沉积增加；肝癌组织胶原纤维明显减少；7.CD31在大鼠肝癌组织内表达强于在肝硬化肝组织内表达；8.Ⅰ、Ⅲ型胶原分布、沉积特点与总体胶原变化一致；9.TPEF、SHG技术分析肝脏胶原结果与传统病理技术分析较一致；结论1.改良型二乙基亚硝胺诱导的伴发肝硬化肝癌模型是较理想的疾病研究模型。2.DEN诱导的大鼠肝脏癌变过程中,胶原纤维在硬化肝组织中沉积明显增加,而在肝癌组织中明显被降解减少,且随着肝癌的进展,癌组织内胶原进一步减少,提示胶原纤维过度沉积发生在肝脏癌变前,而癌变的肝组织内胶原纤维含量则跟癌灶的进展呈负相关；3.CD31在大鼠肝硬化后期、肝癌组织内均有表达,且肝癌组织中的表达要高于肝硬化肝组织,提示肝硬化肝组织内CD31的表达可能跟肝硬化后期的肝窦毛细血管化有关,而在肝癌组织中的进一步高表达则可能肝癌的新生血管有关；4.随着肝硬化的进展,肝组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原与总体胶原沉积均明显增加,在肝癌形成后均明显减少,与基质金属蛋白酶变化呈负相关,提示Ⅰ、Ⅲ型胶原在该疾病模型中能代表肝脏胶原变化趋势,可能与肝癌的预后有关；5.经初步探索,TPEF联合SHG技术跟传统病理技术相比,在判定不同肝纤维化分期上与其较一致,且更省时、省力,减少了人为影响因素,是一种值得推广的肝脏胶原分析手段。应用价值1.改良型二乙基亚硝胺诱导的伴发肝硬化肝癌模型较传统诱导模型,具有重复性好、能精确控制药物摄入量、成癌时间短、成癌率高、死亡率低、与人类疾病模型相似等特点,是一种理想的用于人类疾病研究的动物模型。2.进一步阐明了大鼠肝脏癌变前后组织中胶原纤维的沉积特点,为临床诊断肝癌癌前病变及判定肝癌患者预后提供了参考。初步展示了一种新技术-SHG联合TPEF技术在肝组织内胶原纤维观察中的应用价值,可望促进肝组织胶原分析技术的发展。