论文部分内容阅读
目的：卵巢上皮性癌（Epithelial ovarian cancer）占卵巢恶性肿瘤的90%，是女性的第一杀手。绝大多数患者最终会对铂类为基础的联合化疗方案产生耐药而引起复发，临床治疗的难点是如何提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性，从而改善患者预后。有研究表明胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like growth factor1receptor, IGF-1R）在包括卵巢癌在内的肿瘤的增殖中发挥了重要的作用，与化疗耐药也密切相关，并且IGF-1R高表达还与不良预后相关，但是其在卵巢癌中作用尚未深入研究。本实验建立人卵巢癌细胞系SKOV3异种移植瘤模型，检测顺铂化疗前后移植瘤细胞中IGF-1、IGF-1R的表达差异，应用IGF-IR抑制剂NVP-AEW541，观察抑制IGF-1R后细胞增殖抑制情况及对顺铂敏感度的变化，初步探讨IGF-1R与卵巢上皮性癌顺铂耐药的相关性。方法：1.应用卵巢癌细胞株SKOV3建立异种移植瘤模型细胞：应用20只5-6周的雌性裸鼠建立异种移植瘤模型。用SKOV3细胞分别将细胞接种于裸鼠的大腿部皮下，随机分成两组，10只未治疗组，10只顺铂治疗组，饲养六周，获得的卵巢癌移植瘤细胞命名为SKOV3-P（未化疗组）、SKOV3-R（化疗组）；2.应用免疫细胞化学法检测SKOV3-P、SKOV3-R细胞中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的表达；应用流式细胞术检测SKOV3-P、SKOV3-R细胞中胰岛素样生长因子-1受体(IGF-IR)蛋白的表达；3.应用MTT方法检测，加入不同浓度的NVP-AEW541(0、1、5、10、20μM)，培养24、48、72、96小时，分别检测对SKOV3-P和SKOV3-R细胞生长的影响；4.应用MTT方法检测，加入不同浓度的NVP-AEW541(0、5、10、20μM)联合外源性IGF-I蛋白(50ng/ml)，培养48小时后检测对SKOV3-P和SKOV3-R细胞生长的影响；5.应用MTT方法检测，加入不同浓度的顺铂(0、0.25、2.5、25μg/ml)在培养48小时后检测对SKOV3-P、SKOV3-R细胞生长抑制作用，获得半数抑制浓度（IC50）；6.应用MTT方法检测，加入不同浓度的NVP-AEW541(0、5、10、20μM)联合不同浓度的cDDP (0、1、5、10、15、20μg/ml)，培养48小时后检测对SKOV3-P和SKOV3-R细胞生长的影响；7.应用流式细胞术检测，加入NVP-AEW541(10μM)、NVP-AEW541(10μM)+cDDP(10μg/ml)，48小时后检测SKOV3-P和SKOV3-R细胞凋亡情况；8.统计方法：用spss13.0统计软件，检测数据以(x±s)表示，三组以上比较采用方差分析，组间差异采用LSD法，两组数据比较采用t检验，以P<0.05时作为有统计学差异的标准。结果：1.免疫细胞化学法检测结果显示：SKOV3-P、SKOV3-R细胞的细胞膜和细胞质中均有棕黄色颗粒，说明SKOV3-P、SKOV3-R细胞可以自身分泌IGF-I蛋白。通过免疫细胞化学评分（HIS）法得到SKOV3-P细胞表达值为6.8±2.38，SKOV3-R细胞表达值为9.9±1.87，SKOV3-R细胞表达高于SKOV3-P细胞，两组细胞的表达差异有统计学意义（P<0.05）。2.流式细胞术检测SKOV3-P、SKOV3-R细胞中IGF-IR蛋白的表达：SKOV3-P细胞培养24、48小时后检测得到IGF-IR蛋白的表达分别为205.8±1.05、263.2±5.94，48小时表达量较24小时增高，两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；SKOV3-R细胞培养24、48小时后检测得到IGF-IR蛋白的表达分别为227.7±5.42、280.9±1.57，48小时表达量较24小时增高，两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；SKOV3-P细胞与SKOV3-R细胞相比，SKOV3-R细胞培养24、48小时后的表达量均高于SKOV3-P细胞，其差异具有统计学意义(P<0.05)。3. MTT法测定NVP-AEW541对SKOV3-P和SKOV3-R细胞增殖结果显示均有抑制作用。剂量依赖：NVP-AEW541作用96小时后，随着NVP-AEW541作用浓度的增加，对SKOV3-P、SKOV3-R细胞的抑制作用增加，各实验组抑制率不同(均P<0.05)，两种细胞各个实验组间差异均有统计学意义(P<0.05)。时间依赖：实验组NVP-AEW5410、1、5、10、20μM中，随着作用时间的增加，对细胞的抑制作用增加，SKOV3-P、SKOV3-R细胞24、48、72小时三个时间段细胞抑制率不同(均P<0.05)，各个时间段差异有统计学意义(P<0.05)SKOV3-P细胞与SKOV3-R细胞相比，NVP-AEW541对SKOV3-P细胞抑制率均高于对SKOV3-R细胞的抑制率，其差异具有统计学意义(P<0.05)。4．MTT法测定加入外源性IGF-I蛋白后不同浓度NVP-AEW541对SKOV3-P、SKOV3-R细胞抑制率的变化：不同浓度NVP-AEW541(0、5、10、20μM)中加入IGF-I蛋白(50ng/ml)作用SKOV3-P和SKOV3-R细胞48小时后，单用NVP-AEW541对SKOV3-P细胞或是对SKOV3-R细胞的抑制率与NVP-AEW541联合外源性IGF-I蛋白后对SKOV3-P细胞或是对SKOV3-R细胞的抑制率相比，二者间的差异无统计学意义(P>0.05)；单用NVP-AEW541与NVP-AEW541联合外源性IGF-I蛋白对SKOV3-P细胞的抑制率均明显高于SKOV3-R细胞(均P<0.05)5. MTT法测定不同浓度顺铂作用SKOV3-P和SKOV3-R细胞后得到半数抑制浓度即IC50值，计算SKOV3-P和SKOV3-R细胞cDDP IC50值，SKOV3-P细胞IC50在2.35±0.06μg/ml，SKOV3-R细胞IC50在15.87±0.13μg/ml；SKOV3-R细胞的IC50值明显高于SKOV3-P细胞的IC50值，其差异有统计学意义(P<0.05)。6． MTT法显示不同浓度NVP-AEW541对SKOV3-P和SKOV3-R细胞cDDP敏感性的影响：当NVP-AEW541和cDDP联合应用时，比单独cDDP对SKOV3-P和SKOV3-R细胞增殖抑制作用增强，增强对顺铂的敏感性。SKOV3-P细胞顺铂IC50值为2.35±0.06μg/ml，加入NVP-AEW5415、10、20μM作用后，顺铂IC50值分别为1.04±0.07μg/ml、0μg/ml、0μg/ml，细胞对顺铂敏感性增加（P <0.05）。SKOV3-R细胞顺铂IC50值为15.87±0.13μg/ml，加入NVP-AEW5415、10、20μM作用后，顺铂IC50值分别为5.49±0.07μg/ml、1.14±0.11μg/ml、0μg/ml，细胞对顺铂敏感性增加（P <0.05）SKOV3-P细胞和SKOV3-R细胞相比，SKOV3-P细胞对顺铂的敏感度均高于SKOV3-R细胞对顺铂敏感度，其差异具有统计学意义（P <0.05）7． FCM检测显示药物作用SKOV3-P和SKOV3-R细胞48小时后细胞凋亡率均显著增加，SKOV3-P细胞：NVP-AEW541组和NVP-AEW541+cDDP组的凋亡率分别为(60.17±0.34)%、(82.02±0.49)%，与对照组(8.03±0.72)%相比，细胞凋亡率均显著增加（P <0.05）；SKOV3-R细胞：NVP-AEW541组和NVP-AEW541+cDDP组的凋亡率分别为(42.06±0.75)%、(70.04±0.55)%，与对照组的(4.51±0.51)%相比，细胞凋亡率均显著增加（P <0.01）。SKOV3-P细胞和SKOV3-R细胞相比，药物作用后，SKOV3-P细胞的凋亡率均高于SKOV3-R细胞的凋亡率，其差异有统计学意义（P <0.05）结论：1．IGF-I、IGF-1R在SKOV3-P、SKOV3-R细胞中均有表达，但SKOV3-R细胞中的表达明显高于SKOV3-P细胞，提示IGF-I、IGF-1R蛋白的高表达与卵巢癌细胞顺铂耐药存在相关性；2．IGF-1R抑制剂NVP-AEW541随着作用时间及其浓度的增加，可以有效抑制SKOV3-P、SKOV3-R细胞的生长增殖能力；NVP-AEW541对SKOV3-P细胞的抑制率明显高于SKOV3-R，提示IGF-1R参与了化疗耐药过程；3．NVP-AEW541联合顺铂后，可以提高SKOV3-P、SKOV3-R细胞对化疗药物顺铂的敏感性，增加细胞的凋亡率；SKOV3-P细胞对化疗药物顺铂的敏感性及其凋亡率明显高于SKOV3-R细胞，说明胰岛素样生长因子1受体参与了化疗耐药过程，抑制IGF-1R可以逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药。