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猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是有囊膜的正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)。猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是无囊膜的单链线状DNA病毒,属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)。CSFV和PPV均能导致母猪繁殖障碍性疾病,威胁我国养猪业,一经发病扑杀将给养猪业带来严重经济损失。目前尚未发现针对这两种疫病有效的抗病毒药物,因此针对这两种疫病的有效控制途径仍然以免疫预防为主。蛋白芯片作为新型实验室检测技术,具有高通量、高灵敏度、操作简单方便、快速检测等优点,可用于检测猪群血中的抗原抗体水平,有效监测猪群健康状况。本研究原核表达并纯化了CSFV NS3、NS5B 2种重要的非结构蛋白、PPV核衣壳VP2蛋白,制备了抗CSFVNS3、NS5B蛋白多克隆抗体、抗PPV VP2蛋白多克隆抗体,并建立了用于诊断PPV抗体的蛋白芯片技术。全文研究如下:1.猪瘟病毒和猪细小病毒主要蛋白的原核表达及纯化本研究将CSFV NS5B第239～479位亲水区域、优化密码子后的NS3、优化密码子后的VP2第156-438位氨基酸基因分别克隆至原核表达载体pColdI,转化至大肠杆菌Rossetta 2(R2)。将重组菌经0.1 mmol/L IPTG 18℃诱导16 h,成功表达的重组蛋白使用His标签高亲和力镍磁珠进行纯化。经SDS-PAGE结果显示,本研究成功表达并纯化了重组蛋白CSFV NS3和NS5B、PPV VP2。2.猪瘟病毒、猪细小病毒的多克隆抗体制备及鉴定本研究将成功纯化的重组蛋白NS3、NS5B和VP2,以50～100μg/只的剂量与FCA(1:1)乳化后免疫Balb/c小鼠。首免后每间隔14 d,用重组蛋白经FIA(1:1)乳化后进行二免和三免,三免7d后小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清后即获得多克隆抗体。Western blot结果显示,3种抗血清不仅能分别识别原核和真核表达的NS3、NS5B和原核表达的VP2蛋白,也能识别细胞中感染的CSFV、PPV并产生特异性条带。IFA结果表明,CSFV的2种抗血清除均能与胞浆中的猪瘟病毒粒子发生反应外,也能识别真核表达的NS3和NS5B蛋白;抗PPV VP2多克隆抗体能识别接毒PPV的PK-15细胞蛋白,且能在胞浆中观察到特异性荧光。3.建立蛋白芯片技术诊断猪细小病毒抗体将原核表达并纯化的重组蛋白VP2作为诊断的抗原蛋白,点样至经环氧基修饰的玻片,经过杂交、封闭、洗涤、加入待检血清孵育、洗涤、加入标记的二抗孵育等步骤,优化抗原蛋白浓度、一抗和二抗孵育时间、最佳血清稀释倍数等条件,成功建立了可视化蛋白芯片技术和Cy3荧光标记蛋白芯片技术。可视化蛋白芯片技术的灵敏度可达6000倍稀释,Cy3荧光标记蛋白芯片技术灵敏度可达12800倍稀释。将2种蛋白芯片方法与商品化猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒进行比较,2种蛋白芯片芯片的阳性检出率、灵敏性及特异性均高于ELISA。