对于缺血性脑血管病来说,尚无一疗效突破性药物能从根本上解决脑损伤问题。其主要原因之一是由于血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的阻挡,使得受损脑组织无法获得有效的药物浓度。因此,促进有效药物的脑部转运便成为一个亟待解决的关键问题。缺血性中风属中医“络病”范畴,“毒损脑络”是其病机关键,临床上从络脉的功能特点入手进行论治取得了显著的疗效。虽然络脉不等同于现代医学的微循环,但其结构定位在很大程度上与西医学的微循环相似。从目前络病生物学的基础研究来看,微血管内皮细胞在络病的多个病理环节中发挥着重要作用。现代医学研究也日益认识到,除结构屏障外,由内皮细胞上药物转运体所构成的功能屏障在脑病治疗中也具有重要作用。因此,我们在中医络脉理论的指导下,以有效开启BBB转运功能以提高脑内药物浓度为切入点,研究清开灵有效组分脑部转运与BBB结构与功能的关系,并分析有效组分对P-糖蛋白功能表达的影响,从而开展中药组分配伍以增加BBB主动转运功能而发挥脑保护作用的研究。目的:通过对正常大鼠不同时段脑脊液及血清中清开灵主要有效组分进行分析与对比,寻找清开灵有效组分进入脑组织的特征。同时通过观察脑缺血再灌注不同时间点BBB的形态变化和P-糖蛋白的功能变化,以及分析药物组分对P-糖蛋白表达与功能的影响,寻找清开灵有效组分脑部转运与BBB形态及功能变化的关系,初步揭示清开灵有效组分透过缺血性脑损伤BBB的配伍效应。方法:1.观察清开灵主要有效组分透过正常大鼠BBB的情况:以清开灵注射液中栀子苷、黄芩苷、胆酸和去氧胆酸作为体内样品分析的载体,利用现代分析手段——多维指纹图谱技术测定不同时间点清开灵有效组分在正常大鼠脑脊液和血清中的含量变化。2.观察正常和缺血性脑损伤大鼠BBB的形态学变化:制作脑组织HE染色切片和超薄切片,利用光学显微镜和透射电子显微镜观察正常和缺血再灌注不同时间点BBB形态结构的变化以及脑组织损伤的情况。3.观察脑缺血再灌注损伤大鼠BBB P-糖蛋白表达的时序特征:利用蛋白免疫印迹和免疫组织化学的方法,分析P-糖蛋白在脑缺血再灌注后表达的时序性特征;同时利用免疫电镜方法进行P-糖蛋白的超微结构定位,从一定程度上反映由于蛋白功能表达的改变而可能引起的药物脑部转运的变化。4.清开灵有效组分对大鼠脑微血管内皮细胞P-糖蛋白功能和表达的影响:首先成功培养和鉴定大鼠脑微血管内皮细胞,然后分别利用CCK8细胞活性检测法和蛋白免疫印迹法,分析清开灵有效组分对脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能和表达的影响。5.清开灵有效组分对正常及脑缺血再灌注损伤大鼠BBB形态结构和P-糖蛋白表达的影响:制作脑组织HE染色切片和超薄切片,利用光学显微镜和透射电子显微镜观察清开灵有效组分对正常及脑缺血再灌注损伤大鼠BBB形态结构的影响,采用免疫组织化学方法分析P-糖蛋白的表达情况,结构与功能相结合分析清开灵有效组分透过BBB的协同配伍效应。结果:1.在正常大鼠脑脊液和血清样品中均可检出栀子苷,说明栀子苷透过了BBB。同时,栀子苷呈现相同的积累和消除趋势,达峰时间均在给药后0.2-0.5小时,其中在脑脊液中样品的达峰时间稍有拖后,在0.5小时左右,说明栀子苷透过BBB集中于中枢神经系统中需要一些时间。而黄芩苷、胆酸和去氧胆酸未能在脑脊液中检出,说明三者可能均无法透过BBB。但胆酸作为内源性物质,在3小时产生双峰现象,这可能是由于体内代偿性胆酸分泌所致。2.动态观察缺血再灌注损伤状态下BBB的形态结构发现,再灌注的时间与BBB通透性的变化密切相关。再灌注0小时和0.5小时,微血管管周间隙变大,开始出现水肿,内皮细胞轻度肿胀,但此时BBB的紧密连接未完全开放,机体处于代偿阶段,通透性略有增加。再灌注2小时和6小时,血管内皮细胞空泡化明显,有炎细胞浸润,说明此阶段内皮细胞膜通透性开始增大,同时星形胶质细胞的足突与微血管基底膜分离程度渐大,此时BBB通透性在进一步增大。再灌注12小时和24小时,由于BBB的各组成结构均发生了严重损害,可观察到此阶段三层结构都有很大程度破坏,故此时BBB通透性应该最大。到再灌注48小时和72小时,缺血区多数血管内皮细胞形态不完整,但管周间隙变小,水肿有所减轻,以72小时显著。但大量的神经细胞和胶质细胞坏死、崩解,并可见脑组织中大量的小胶质细胞,提示组织的修复已经开始,故BBB通透性在一定程度上有所降低,以72小时更显著。3.通过两种检测手段发现,P-糖蛋白表达量的变化可分三个阶段:第一阶段(再灌注0h-6h)与正常组相比P-糖蛋白表达量下降到最低。因再灌注早期损伤进一步加重,大量释放的炎症介质引起内皮细胞的损伤;同时P-糖蛋白的表达量骤减,导致BBB外排功能减弱。其中再灌注1/2小时可能由于机体的代偿引起蛋白表达量的回升,但很快又回落到最低点。第二阶段(再灌注12h-72h)蛋白表达量逐渐增加。P-糖蛋白的增加较BBB结构恢复来得更快,新合成的P-糖蛋白会很快装配到细胞膜上,来代偿因结构破坏而导致的BBB通透性的增加,发挥外排有害物质维持脑内环境稳定的作用。第三阶段(再灌注4d-10d)P-糖蛋白的表达量明显增多而几乎接近正常。第4天由于内皮细胞和星形胶质细胞明显分裂增生出现修复,致使P-糖蛋白的表达量骤增。P-糖蛋白表达水平的变化从一定程度上可以反映其功能的改变。4.无论是正常还是缺血损伤的大鼠脑微血管内皮细胞,当长春新碱(VCR)浓度为10nM和20nM时,栀子苷与胆酸均能对抗VCR的细胞毒作用,提高内皮细胞活性。综合阳性药维拉帕米的作用,我们推测栀子苷与胆酸可能是通过增强P-糖蛋白的外排功能,使VCR大量被泵出细胞外,从而保护内皮细胞免受损伤。而当VCR浓度达到30nM时,两者则无法对抗其毒性作用,可能是由于VCR浓度过高致使细胞毒作用过强所致。通过研究清开灵有效组分对P-糖蛋白表达的影响,发现栀子苷对该蛋白的表达几乎没有影响;而令我们感到意外的是,胆酸则通过提高P-糖蛋白的表达量使VCR大量外排,提高了细胞活性。但黄芩苷和清开灵在整个实验中并没发挥对抗VCR的作用,未能起到保护内皮细胞的作用。并且在模型组中,VCR+清开灵反而加重了细胞损伤,说明清开灵在此种条件下可能具有一定的毒性作用。5.正常用药组中除黄芩苷外,其他有效组分对BBB结构均无显著影响-:三层结构完整,内皮细胞和足突无水肿,微血管管周无明显间隙。只有黄芩苷组血管周围间隙略有增大,出现水肿征象,考虑黄芩可能在一定程度上能增大BBB的通透性。而对于模型用药组来说,三个有效组分单独使用对水肿现象的改善并不十分明显,但清开灵组却使微血管周围间隙明显变小,水肿获得减轻,微血管未见扭曲变形,管周组织损伤减轻。所以与其他用药组相比,清开灵可显著减轻脑水肿,并降低BBB的通透性,起到双重保护的作用。结论:1.清开灵的四种主要有效组分栀子苷、黄芩苷、胆酸和去氧胆酸在血清中的经时变化规律是随时间延长而浓度渐低,其中只有栀子苷可透过正常BBB,在脑脊液中的达峰时间与血清相比略有延迟。而其他药物组分有可能通过影响BBB的结构与功能而增加栀子苷的脑部转运。2.缺血再灌注早期,P-糖蛋白表达与BBB形态结构的变化趋势相反,前者的变化程度较后者更为明显,BBB通透性开始增加。中期,两者变化趋势仍相反,组织结构还未获得明显的修复,而功能蛋白的合成已不断增加。由于组织结构受损严重,所以新合成的功能蛋白难以弥补结构屏障的破坏,此期BBB通透性进一步增加。晚期,两者共同正向变化,BBB通透性降低。由此可见,缺血再灌注状态下BBB结构与功能的改变与再灌注时间密切相关。BBB超微结构的改变不仅增加了治疗药物的漏过,而且使得血中有害物质大量入脑,引起脑组织损伤。所以,在改善和重建BBB形态结构和降低其通透性的前提下,有效开启BBB转运功能以增加有效药物组分的脑部转运,才是治疗脑部疾患的根本途径。3.清开灵有效组分在透过正常及缺血性脑损伤BBB中具有协同配伍效应,各组分的作用靶点各有侧重。黄芩苷可能引起微血管通透性的增强;栀子苷不仅可以有效减轻脑微血管内皮细胞的损伤,而且可以透过BBB直接保护受损神经元;而胆酸通过增强P-糖蛋白的表达来外排有害物质入脑,减轻BBB破坏造成的脑损伤;清开灵则可明显减轻脑水肿。所以,以上作用特点从另一层面揭示了清开灵“解毒通络”的作用机制;同时也表明,从中药有效组分配伍应用来寻求高效低毒的外排转运体逆转剂可以为脑病治疗药物的研发开辟出一条更有效的途径。4.清开灵治疗缺血性脑损伤具有良好的疗效,其效果的取得与有效组分透过BBB及影响BBB的形态结构和功能有关。中药配伍应用发挥多环节、多靶点的保护作用,既对损伤BBB结构有改善和重建作用,又可通过影响药物转运体而提高有效组分的脑内浓度并改善脑神经的功能。这种作用机制正体现了中药有效组分的协同配伍作用,同时也可能是阐明中药治疗缺血性脑损伤作用机理和作用途径的关键环节。