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土壤微生物总RNA的提取是研究土壤微生物分子生态学的基础,在研究土壤微生物群落多样性分布与功能的关系时,需要从土壤中提取出高质量的RNA样品。RNA是在转录水平上的研究,是微生物生理生化过程的主要依据,从RNA层面上研究,能及时地发现土壤微生物对外界环境发生变化时的响应能力。因此,建立一种土壤微生物总RNA的提取方法能为土壤微生物群落及功能方面的研究提供材料基础。本研究建立了一种土壤微生物总RNA的提取方法,该法可稳定、高效的提取土壤微生物总RNA。本实验以壤土为研究对象,重复使用该法试验6次,提取结果显示:壤土 RNA浓度平均值为167.15 ng/μL,变异系数仅为10.29%。与Omega试剂盒相比,该法提取效率较高,其中壤土提取效率是试剂盒的7倍,粘土提取效率是试剂盒的4倍,砂土提取效率与试剂盒相差不显著。此外,利用IlluminaMiSeq二代高通量测序技术对三种土壤DNA和cDNA样品进行土壤微生物群落多样性和丰富度研究,在DNA和cDNA水平上比较.自养固碳微生物群落多样性的差异。本论文具体研究成果如下:1、采用传统的Trizol法对壤土、纯菌落(大肠杆菌)和植物(拟南芥)三种样品进行总RNA的提取,结果发现Trizol法对于土壤微生物总RNA的提取结果较差,而大肠杆菌菌液和拟南芥提取效果良好,说明Trizol试剂不适用于具有复杂环境的土壤样品,推测可能与土壤的异质性有关,土壤微生物常与土壤颗粒及其它杂质混合在一起,微生物相对分散且被土壤包裹。此外,与其它裂解试剂相比,Trizol试剂裂解能力稍弱。2、在CTAB-SDS法的基础上通过改变提取液pH、裂解时间及沉淀时间,得到一种适用于壤土、粘土、砂土三种土壤的RNA提取方法,同时通过与Omega公司的soil RNA kit的效果对比发现,Omega公司的试剂盒在三种土壤的适用性上存在差异,适用性上为:砂土>粘土>壤土,而CTAB-SDS优化法对三种土壤的提取质量差异不显著,在CTAB-SDS优化法提取出的RNA经DNA去除、RNA纯化、cDNA合成后,可应用于后续16S和cbbM基因的扩增。3、应用IlluminaMiSeq高通量测序技术分析壤土、粘土、砂土三种土壤中DNA和cDNA样品的cbbM基因群落结构,比较三种土壤中DNA和cDNA样品微生物群落多样性的差异。结果表明CTAB-SDS优化法提取的土壤RNA可应用于高通量测序分析,其中在多样性指数上,壤土、粘土、砂土三种土壤DNA样品均高于三种土壤cDNA样品,通过对比DNA与cDNA样品,发现Acidithiobacillus、Sulfuritalea、Thiobacillus、Magnetospirillum、Thiohalomonas、Thioflavicoccus、Thiomonas、Acidihalobacter、Sulfuritalea、Ferriphaselus、Gallionella、Thiocystis 等变化较为明显。此外,在重复性方面,壤土 DNA样品重复性最好,相似度平均值为94.98%,砂土DNA样品重复性最差,相似度平均值仅为49.74%,在重复间稳定性方面,壤土和粘土样品变异系数均在2%左右,壤土 DNA样品稳定性最好,变异系数仅为1.14%,而砂土样品稳定性最差,变异系数为58.70%。