第一部分结直肠癌细胞系中p33ING1b基因表达与表观遗传修饰状态的关系目的ING1基因是1996年发现的一个肿瘤抑制基因,目前的研究发现其转录剪接体p33ING1b mRNA在的人类多种肿瘤中表达下调,但其机制并未明确。本研究旨在从p33ING1b基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化的表观遗传修饰状态与基因表达的关系,初步探讨结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中p33ING1b转录抑制的机制。方法对体外培养的结直肠癌细胞系HT29、LOVO、HCT116、COLO205,采用RT-PCR结合Real-time qPCR的方法检测其p33ING1b mRNA的表达,用巢式-甲基化特异性PCR(nested methylation specific polymerase chain reaction,nMSP)分析其p33ING1b启动子甲基化状况,用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)结合Real-time qPCR方法检测其p33ING1b组蛋白乙酰化状况,用Western Blot检测其p33ING1b蛋白表达,HT29、LOVO、COLO205与HCT116比较,分析结直肠癌不同细胞系p33ING1b的表观遗传修饰状态与基因表达关系。结果1 HT29、LOVO、COLO205与HCT116结直肠癌细胞均有不同程度的p33ING1b mRNA表达。与HCT116比较,HT29和LOVO的p33ING1b mRNA的表达稍高(P>0.05),而COLO205的表达则较高(P<0.01),COLO205的表达比HT29和LOVO高(P<0.01)。2结直肠癌细胞株HT29、LOVO检测为p33ING1b基因启动子半甲基化,HCT116则检测出甲基化,而COLO205则未检测出p33ING1b甲基化。3在HT29、LOVO、COLO205与HCT116结直肠癌细胞中,p33ING1b基因启动子头部和尾部2个片段组蛋白H3乙酰化程度检测结果相似(r=0.997)。4株细胞的p33ING1b组蛋白H3乙酰化程度不同。与HCT116比较,HT29和LOVO的乙酰化水平较高(P<0.05),而COLO205的则更高(P<0.01)。COLO205的乙酰化水平较HT29和LOVO的高(P<0.01)。4 HT29、LOVO、COLO205与HCT116结直肠癌细胞均有不同程度的p33ING1b蛋白表达。结直肠癌细胞株HCT116 p33ING1b蛋白表达较低,HT29、LOVO的则明显升高,COLO205的较高(P<0.05),而HT29、LOVO和COLO205三者无统计学差别(P>0.05)。5在HT29、LOVO、COLO205与HCT116结直肠癌细胞株中,非甲基化细胞株COLO205的p33ING1b组蛋白H3乙酰化水平及mRNA的表达相对较高,p33ING1b蛋白表达水平亦高,而甲基化的细胞株HCT116的则较低,但在半甲基化的细胞株HT29、LOVO中p33ING1b组蛋白H3乙酰化水平及mRNA的表达中等,但其p33ING1b蛋白表达水平仍在较高水平。p33ING1b蛋白表达与p33ING1b片段1、片段2组蛋白H3乙酰化及mRNA中到高度相关(r=0.667至0.727)。结论1结直肠癌细胞系中有不程度的p33ING1b mRNA表达,其表达水平与蛋白表达水平正相关,提示抑癌基因p33ING1b沉默与结直肠癌的发生发展有关。2结直肠癌细胞系中有不程度的p33ING1b基因启动子过甲基化及组蛋白乙酰化水平降低,提示抑癌基因p33ING1b启动子过甲基化、组蛋白低乙酰化参与结直肠癌的发生发展,p33ING1b启动子甲基化和组蛋白乙酰化是结直肠癌的频发事件。3结直肠癌细胞系中不程度的p33ING1b mRNA表达水平与基因启动子甲基化负相关,与基因启动子组蛋白乙酰化水平正相关,提示结直肠癌细胞系p33ING1b mRNA表达下调与基因启动子甲基化、组蛋白乙酰化有关。4 p33ING1b基因启动子过甲基化和组蛋白低乙酰化是导致结直肠癌细胞系p33ING1b基因转录抑制的原因之一,但可能还存在其他机制如其他表观遗传修饰或其上游转录调控机制的异常改变导致p33ING1b的转录抑制。第二部分表观遗传学干预对结直肠癌细胞系表观遗传修饰及p33ING1b基因表达的影响目的研究发现抑癌基因ING1与结直肠癌关系密切,其转录剪接体p33ING1b mRNA在结直肠癌中表达下调,且存在过甲基化和去乙酰化状态,但其机制并未明确。本研究旨在通过体外表观遗传学干预,从p33ING1b启动子甲基化和组蛋白乙酰化的表观遗传状态改变与基因表达的关系,进一步探讨结直肠癌中p33ING1b转录抑制的表观遗传机制。方法通过曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)及5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza- 2’-deoxycytidine,5-Aza-2’-dc)对体外培养的结直肠癌细胞系HT29、LOVO、HCT116和COLO205行恢复乙酰化和去甲基化干预,HT29、LOVO、HCT116和COLO205实验干预TSA组(100μg/L的TSA作用细胞24h)、Aza组(1.2 mg/L的5-Aza-2’-dc作用细胞72h)、Aza+TSA组(先5-Aza-2’-dc作用细胞48h后,TSA作用细胞24h)分别与对照组(无加药干预)比较。采用RT-PCR结合Real-time qPCR的方法检测其p33ING1b mRNA表达的变化,用nMSP方法分析其p33ING1b启动子甲基化状态的改变,用ChIP方法检测其p33ING1b乙酰化状态的改变,用Western Blot检测其p33ING1b蛋白表达的变化,分析结直肠癌不同细胞系p33ING1b的表观遗传修饰状态改变与基因表达的关系,进一步探讨p33ING1b表观遗传修饰在结直肠癌中基因沉默中的机制。结果1单独使用TSA及5-Aza-2’-dc均轻微上调HT29、LOVO和HCT116 p33ING1b mRNA的表达水平(P<0.05),联合使用5-Aza-2’-dc及TSA可以明显上调它们p33ING1b mRNA的表达水平(P<0.01)。而单独使用TSA及5-Aza-2’-dc均轻微上调COLO205 p33ING1b mRNA的表达,但无统计学差别(P>0.05),联合使用5-Aza-2’-dc及TSA则上调COLO205 p33ING1b mRNA的表达(P<0.05)。2用5-Aza-2’-dc及5-Aza-2’-dc+TSA干预后HT29、LOVO由p33ING1b启动子半甲基化逆转为非甲基化,HCT116由p33ING1b启动子甲基化逆转为半甲基化,干预后COLO205则仍未检测出p33ING1b甲基化。TSA干预后各结直肠癌细胞株甲基化无改变,3表观遗传学干预对用p33ING1b片段1和片段2的组蛋白乙酰化作用相似。TSA干预后结直肠癌细胞株HT29、LOVO、HCT116和COLO205 p33ING1b染色质DNA的组蛋白H3乙酰化水平升高(P<0.05)。用5-Aza-2’-dc干预后结直肠癌细胞HT29、LOVO和HCT116 p33ING1b染色质DNA的组蛋白H3乙酰化水平轻微升高(P>0.05),而对COLO205影响不大。而用5-Aza-2’-dc+TSA干预后HT29、LOVO、HCT116和COLO205 p33ING1b染色质DNA的组蛋白H3乙酰化水平明显升高(P<0.01)。4单独使用TSA及5-Aza-2’-dc干预后均使HT29、LOVO和HCT116 p33ING1b蛋白表达增加(P<0.01),而使COLO205 p33ING1b蛋白表达增加不显著(P<0.05),联合使用5-Aza-2’-dc及TSA可以明显增加它们p33ING1b蛋白表达(P<0.01),以HCT116作用最明显。5对照组非甲基化细胞株COLO205 p33ING1b组蛋白H3乙酰化水平及mRNA的表达相对较高,p33ING1b蛋白表达水平亦高,用TSA、5-Aza-2’-dc及5-Aza-2’-dc+TSA干预后,其mRNA的表达、乙酰化水平及p33ING1b蛋白表达水平均有不同程度升高,以5-Aza-2’-dc+TSA干预作用明显(P<0.05)。6对照组半甲基化细胞株HT29及LOVO p33ING1b组蛋白H3乙酰化水平、mRNA的表达及p33ING1b蛋白表达水平中等,TSA干预后其甲基化不能被逆转,5-Aza-2’-dc干预后其甲基化被逆转,其mRNA的表达、乙酰化水平及p33ING1b蛋白表达水平均有不同程度升高(P<0.05),用5-Aza-2’-dc +TSA干预后其甲基化被逆转,其乙酰化水平、mRNA的表达及p33ING1b蛋白表达水平变明显升高,差别有统计学意义(P<0.01),干预后细胞生长抑制中等。7对照组甲基化的细胞株HCT116 p33ING1b组蛋白H3乙酰化水平及mRNA的表达相对较低,p33ING1b蛋白表达水平亦低,TSA干预后,其甲基化不能逆转,其mRNA的表达、乙酰化水平及p33ING1b蛋白表达水平轻度升高(P<0.05);5-Aza-2’-dc干预后,其甲基化被逆转,其mRNA的表达及p33ING1b蛋白表达水平同时轻度升高(P<0.05),但乙酰化水平轻微升高(P>0.05);但是经5-Aza-2’-dc干预后,再经TSA干预,其甲基化被逆转,其mRNA表达、乙酰化水平及p33ING1b蛋白表达水平明显升高(P<0.01),干预后细胞生长抑制明显,顺序反之不然。p33ING1b启动子组蛋白H3乙酰化与mRNA表达、蛋白表达中到高度正相关(r=0.564至0.713),与甲基化负相关。结论1结直肠癌细胞系抑癌基因p33ING1b启动子CpG岛过甲基化与p33 ING1b基因沉默相关,甲基转移酶抑制剂5-Aza-2’-dc可使抑癌基因p33 ING1b去甲基化,使p33ING1b基因表达上调。2结直肠癌细胞系抑癌基因p33ING1b基因乙酰化与DNA甲基化负相关,组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA使p33ING1b基因乙酰化水平上调,部分拮抗DNA过甲基化产生的p33ING1b基因表达沉默。3对于p33ING1b基因启动子过甲基化的结直肠癌细胞株HCT116,单用组蛋白去乙酰化酶抑制TSA作用其乙酰化水平升高,但基因表达上调不明显,但如果先用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-2’-dc处理使基因获得轻度的重新表达,再用组蛋白去乙酰化酶抑制TSA处理后,则可使结肠癌细胞基因重新表达显著增强,组蛋白去乙酰化和DNA过甲基化共存于基因失活的过程之中,但DNA的高甲基化在导致p33ING1b基因沉默中可能扮演主导作用。4在结直肠癌p33ING1b的转录抑制中,除p33ING1b基因启动子甲基化和乙酰化外,或还存在其他机制如其他表观遗传修饰机制或其上游转录调控机制的异常改变。