论文部分内容阅读
第一部分抑癌基因ARID2对肝癌细胞增殖和迁移能力调控的研究目的:构建含ARID2 CDS全长质粒的腺病毒,探讨ARID2调控肝细胞肝癌增殖和迁移能力的潜在机制。方法:构建p Ad-track-TO4-ARID2重组质粒,并包装成腺病毒。在人肝癌细胞系中分别转染野生型p GL3-cyclin D1或p GL3-cyclin D1突变体,野生型p GL3-cyclin E1或p GL3-cyclin E1突变体或p GL3-CD44报告质粒,并给予感染腺病毒Ad ARID2或Ad GFP处理后,双荧光素酶实验检测该报告质粒相对荧光素酶活性变化。免疫组化实验检测和Western-Blot技术检测不同组织(正常肝组织、肝癌及癌旁组织)ARID2蛋白在细胞中的定位和表达情况。Western blot检测过表达ARID2对跨膜糖蛋白CD44表达的影响。细胞迁移实验检测过表达ARID2对细胞迁移和侵袭能力的影响,并在荷瘤裸鼠实验中观察体内肿瘤的生长情况。数据之间的两两比较采用独立样本的t检验,多组间的比较采用单因素方差分析。结果:双荧光素酶实验结果表明:与对照组p GL3-Basic相比,GFP组的相对荧光素酶活性无明显改变(p>0.05);与对照组GFP相比,过表达ARID2可以明显抑制p GL3-cyclin D1、p GL3-cyclin E1的启动子活性。Hep G2、SK-Hep1细胞的启动子活性抑制率分别为51.72%±1.4%(t=86.46,p<0.05)和22.06%±1.1%(t=38.15,p<0.05);突变ARID2与cyclin D1、cyclin E1启动子区的结合位点,ARID2将不能够抑制cyclin D1/E1启动子活性,该荧光素酶活性得到部分回复。通过在Hep G2细胞和Huh7细胞中分别转染两种不同长度的CD44报告基因质粒(p GL3-CD44-791~+224bp和p GL3-CD44-400~+224bp),p GL3-CD44报告质粒的相对荧光素酶活性均有不同程度的提高,而变化较明显的p GL3-CD44-791~+224b报告质粒的相对荧光素酶在给予过表达ARID2处理后,CD44基因的荧光素酶活性反而明显下调。在Hep G2、Huh7细胞中其抑制率分别为73.83%±0.92%(t=116.24,p<0.05)和48.99%±1.37(t=42.56,p<0.05)。外源性过表达ARID2能够明显抑制CD44蛋白表达。ARID2影响CD44启动子活性进而抑制其蛋白表达,调控肝癌细胞的迁移能力。免疫组化实验和Western-Blot技术发现ARID2蛋白在肝癌组织中的蛋白表达和核染色明显低于正常肝组织和癌旁组织。细胞迁移实验证实过表达ARID2可以明显抑制人肝癌细胞的迁移能力,在Hep G2和Huh7细胞中其抑制率分别为66.95%±0.59(t=30.815,p<0.05)和73.86%±0.49(t=111.276,p<0.05)。动物实验结果表明,ARID2明显延缓或抑制荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长,其抑制率为98.57%±0.34%(t=18.123,p<0.05)。结论:外源性过表达ARID2可以明显下调PGl3-cyclin D1/E1的荧光素酶活性,突变ARID2与cyclin D1/E1启动子区的结合位点,该荧光素酶活性得到部分回复。ARID2与cyclin D1/E1相互作用从而发挥抗肝癌细胞增殖的作用。ARID2也可抑制侵袭相关转录因子CD44启动子活性和CD44蛋白表达,并在肝癌细胞侵袭和迁移实验和荷瘤裸鼠模型中,可见ARID2明显抑制肿瘤细胞的生长和迁移能力。在肝癌组织中ARID2蛋白表达明显低于癌旁组织。ARID2蛋白胞核染色也较正常肝组织和癌旁组织少。以上实验提示cyclin D1、cyclin E1与CD44在ARID2调控肝癌细胞生物学功能过程中可能发挥了重要的作用。该研究为阐明ARID2在调控肝癌细胞生物学功能方面所发挥的抑制作用以及寻找肝癌治疗方案提供了新的研究方向。第二部分ARID2对肝癌细胞凋亡的调控的研究目的:探讨ARID2对人肝癌细胞系凋亡的影响,明确ARID2是否是通过线粒体信号通路诱导肿瘤细胞的发生凋亡。方法:人肝癌细胞系Hep G2、SK-Hep1分别被转染ARID2质粒96h后,并给予Annexin V-FITC/7-AAD,DHE,JC-1染料染色30min后。流式细胞术分别被用于检测肝癌细胞的凋亡率、细胞内活性氧类(ROS)水平以及肝癌细胞的线粒体膜势能的变化。荧光显微镜被用于观察染色后肝癌细胞形态学的变化。采用RT-PCR与Real-time PCR技术检测肝癌细胞线粒体凋亡信号通路中相应靶基因。Western-Blot技术进一步观察其蛋白表达情况。结果:与对照组相比,Hep G2细胞和SK-Hep1细胞感染Ad ARID2腺病毒后96h,凋亡率分别为15.43%和16.71%,且其凋亡率分别增加了1.59±0.17倍(p﹤0.05)和1.58±0.56倍(p﹤0.05)。DHE染色发现ARID2可以明显增加肝癌细胞内的ROS水平。ARID2组较对照组相对荧光强度增加了3.41±0.34倍,(p﹤0.05,Hep G2);3.50±0.52倍,(p﹤0.05,SK-Hep1)。ARID2可以明显降低肝癌细胞的线粒体膜势能,且发现在ARID2也可以减少JC-1染色后的肝癌细胞的聚合物/单聚体的相对荧光强度。Hep G2、SK-Hep1细胞中的聚合物/单体的相对荧光强度分别降低了21.69%±1.2%(p﹤0.05)、41.38%±1.9%(p﹤0.05)。RT-PCR、实时荧光定量PCR以及Western-Blot技术检测发现肝癌细胞中给予过表达ARID2处理96h后,抗凋亡基因Bcl-w与Mcl-1呈现低表达,促凋亡基因Bax在ARID2处理的标本中则高表达。caspase级联反应相关Caspase9、3蛋白表达均明显增加。Caspase效应因子caspase3和PARP明显激活,可见切割型的caspase3和PARP的表达。结论:我们初步观察到外源性过表达ARID2可能通过线粒体信号通路促进肝癌细胞凋亡,其具体作用机理则有待我们进一步研究。