论文部分内容阅读
心脏是胚胎发育最早形成并发挥功能的重要器官,心脏形成发育需要各种复杂而精密的遗传调控程序在时间和空间上相互协调,并涉及众多相关基因的顺序表达及多条信号通路(如BMP信号通路、Wnt信号通路、FGF信号通路、Notch信号通路等)的准确调控,任意基因的突变或缺失都可能导致心脏发育畸形。因此,从基因和分子水平探索胚胎心脏形成及发育机制为先天性心脏病的防治提供了新的方向。近年来,许多科学家发现microRNA (miRNA)在先天性心脏病中功能活跃。miRNAs是一组由19-23个核苷酸组成的非编码小RNA,其可以通过与靶基因mRNA3’UTR区域结合,介导mRNA降解或抑制其转录后水平的表达,导致靶标蛋白表达降低,从而参与并调控时序发育、细胞凋亡、细胞分化、激素分泌等多种生理过程及多种疾病发生过程。本实验小组前期通过生物芯片技术筛选发现,miR-20b差异高表达于孕中期室间隔缺损胚胎心脏组织。mmu-miR-20b属于miR-17前体家族,其在进化上高度保守,并且在斑马鱼、家鼠等多种生物的胚胎心脏中均有不同程度的表达。目前有关miR-20b致胚胎心脏发育畸形及其机制的研究尚无文献报道。因此本实验通过改变miR-20b的表达水平,观察其对心脏发育过程的影响。研究总共分为三部分,分别阐述mmu-miR-20b过表达、沉默对P19细胞增殖、凋亡、分化、BMP信号通路以及线粒体功能的影响,分析miR-20b对P19细胞向心肌样细胞分化影响的机制,探讨其在胚胎心脏发育中的作用及致畸的可能机制,从而可能有助于分析先天性心脏病发生的病理生理基础。第一部分miR-20b过表达对P19细胞增殖、分化、凋亡及BMP信号通路的影响目的：通过构建miR-20b过表达质粒,使P19细胞中miR-20b表达上调,从而观察其对P19细胞增殖、分化、凋亡的影响。方法：设计并构建mmu-miR-20b过表达载体,将其与空白对照载体分别转染P19细胞,并用杀稻瘟菌素筛选14d,应用实时荧光定量PCR法验证稳定表达细胞株。采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞仪检测niR-20b过表达对P19细胞周期的影响、实时荧光定量PCR法检测其对P19细胞分化的影响,并用磷脂酰外翻法、Capase-3活性检测及Hoechst染色等方法分析其对细胞凋亡的影响。利用Western blot法检测BMP信号通路相关蛋白的表达水平。结果：成功构建并验证了mmu-miR-20b过表达稳定细胞株。miR-20b过表达可抑制细胞增殖,使其受阻于S/G2期,并促进细胞凋亡。miR-20b过表达通过促进BMP信号通路相关蛋白的表达,从而促进了P19细胞分化成为心肌样细胞。结论：miR-20b过表达具有抑制P19细胞增殖、促进其分化及凋亡的作用。第二部分miR-20b过表达对心肌样细胞线粒体功能的影响目的：研究miR-20b过表达对心肌细胞线粒体功能的影响。方法：体外培养miR-20b过表达稳定细胞株,用1%DMSO (Dimethyl sulfoxide DMSO)诱导10d使其分化成为心肌样细胞。应用荧光定量PCR法检测miR-20b过表达对心肌样细胞线粒体DNA拷贝数的影响、生物发光法检测其对线粒体ATP的影响,采用DCFDA (2,7-Dichlorofluorescein diacetate, DCFDA)荧光探针及激光共聚焦检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的变化、JC-1荧光探针及激光共聚焦检测线粒体膜电位的变化。结果：miR-20b过表达对心肌样细胞线粒体DNA拷贝数无明显影响；miR-20b过表达使心肌样细胞中线粒体ATP增加；miR-20b过表达使心肌样细胞ROS水平升高、线粒体膜电位下降。结论：miR-20b过表达可能对心肌样细胞线粒体功能有一定程度的损害作用。第三部分miR-20b表达沉默对P19细胞的分化、凋亡、BMP信号通路及线粒体功能的影响目的：通过构建miR-20b表达沉默的“海绵”(sponge)质粒,使P19细胞中miR-20b表达下调,探讨其对P19细胞分化、凋亡及线粒体功能的影响。方法：设计并构建mmu-miR-20b表达沉默的sponge质粒,将其与空白对照载体分别转染P19细胞,并用嘌呤霉素筛选14d,应用双荧光素酶报告基因系统法验证沉默表达稳定细胞株。采用实时荧光定量PCR法检测miR-20b表达沉默对P19细胞分化的影响,并用磷脂酰外翻法、Capase-3活性检测及Hoechst染色等方法分析其对细胞凋亡的影响；利用Western blot法检测BMP信号通路相关蛋白的表达水平；应用荧光定量PCR法检测miR-20b表达沉默对细胞线粒体DNA拷贝数的影响、生物发光法检测其对线粒体ATP产量的影响、DCFDA (2,7-Dichlorofluorescein diacetate, DCFDA)荧光探针及激光共聚焦检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的变化、JC-1荧光探针及激光共聚焦检测线粒体膜电位的变化。结果：1)成功构建并鉴定了mmu-miR-20b沉默表达稳定细胞株；2)miR-20b表达沉默通过抑制BMP信号通路活性来抑制P19细胞向心肌样细胞分化；3)miR-20b表达沉默抑制P19细胞的增殖；4)miR-20b表达沉默对线粒体DNA拷贝数无明显影响；5)miR-20b表达沉默细胞ATP产量降低；6)miR-20b表达沉默细胞中ROS水平降低,线粒体膜电位呈上升趋势。结论：miR-20b表达沉默具有抑制P19细胞分化及凋亡的作用,并可能有利于线粒体正常功能的维持。