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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON),又名呕吐毒素(vomitoxin),是由镰刀菌属病原真菌产生的真菌毒素之一。研究报道DON具有很强的细胞毒性,对于原核细胞、真核细胞等均具有明显的毒性作用,DON可抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,抑制线粒体功能并诱导细胞凋亡。目前关于DON诱导的细胞凋亡多集中于对其免疫机制的研究,而关于线粒体途径的分子机制报道很少。本试验选用对DON敏感细胞HT-29为研究对象,研究在DON不同浓度梯度作用下,观察体外培养的HT-29细胞的形态学变化；在DON不同浓度梯度作用和时间梯度作用下,诱导HT-29细胞凋亡的线粒体途径中关键凋亡蛋白细胞色素C(Cyt C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 (Caspase-9)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况；以及在DON不同浓度梯度作用下,重要的调节肿瘤凋亡基因Bcl-2家族中,关键调节因子Bcl-2、Bax和Bid的表达情况。旨在探讨DON诱导体外培养细胞的细胞凋亡下,对线粒体途径中关键调节蛋白及因子的影响,为深入研究DON的细胞毒性研究分子机制提供依据。试验一本试验将处于对数生长期的HT-29细胞以不同浓度的DON (DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng·mL-1)进行处理,另设空白培养基对照组。24 h后,倒置显微镜和透射电子显微镜下观察细胞的形态学变化。结果显示：不同浓度的DON对HT-29细胞均有诱导凋亡的作用。光学显微镜下,随着DON浓度的增加,HT-29细胞数量明显减少,提示DON能够抑制HT-29细胞的生长。透射电镜下,对照组细胞可见清晰的细胞核和细胞器,周生微绒毛,染色质聚集,线粒体可见细丝状的嵴。而5个试验组细胞均可见典型的凋亡形态学变化,主要表现为细胞核皱缩、碎裂,染色质聚集并靠近核膜,周生微绒毛变少甚至消失,有的出现凋亡小体,细胞器线粒体肿胀、空泡化。试验二：本试验将处于对数生长期的HT-29细胞以不同浓度的DON (DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng·mL-1),另设空白培养基对照组,进行处理24 h后,采用SDS-PAGE凝胶分离蛋白,Western blotting分析CytC、Caspase-9、Caspase-3和内参蛋白β-actin的表达。结果显示：不同浓度DON作用HT-29细胞24 h之后,DON浓度分别为1000、500、1000 ng·mL-1时,达到诱导激活凋亡蛋白Cyt C、Caspase-9和Caspase-3相对表达量的峰值,与对照组差异均极显著(P<0.01)。HT-29细胞Caspase-9蛋白的相对表达量在DON浓度为125-500 ng mL-1范围时,随DON浓度增高而增多。Caspase-3蛋白的表达量在500-1000 ng mL-1范围时,随DON浓度增高而升高,在2000 ng mL-1时,相对表达量有所下降；Cyt C的表达量在125-1000 ng mL-1范围时,随DON浓度升高也逐渐升高,在2000 ng mL-1时表达略微下降。同时,将处于对数生长期的HT-29细胞,以DON 500 ng. mL-1处理HT-29细胞,作用细胞0、3、6、12、24、48 h后,同样采用SDS-PAGE凝胶分离蛋白,Western blotting分析Cyt C、Caspase-9、Caspase-3和内参蛋白p-actin的表达情况。结果显示：凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3均在DON作用HT-29细胞12h后,其相对表达量达到峰值,与对照组差异极显著(P<0.01)；随着DON作用时间的延长,24、48 h后,两者蛋白的相对表达量逐渐下降,但Caspase-9表达量略低于对照组,Caspase-3反高于对照组。凋亡蛋白Cyt C于DON作用6 h后,其表达量达到峰值,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。随作用时间的延长,其表达量呈下降趋势,并且在作用24、48 h后,表达量明显低于对照组。试验三：本试验将处于对数生长期的HT-29细胞以不同浓度的DON (DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng·mL-1)进行处理,另设空白培养基对照组。24 h后,用荧光定量PCR方法检测Bcl-2、Bax、Bid基因和内参基因GAPDH的变化。结果显示：目的基因Bcl-2、Bax、Bid随DON浓度的增加,Bcl-2和Bax其相对表达量分别在500、1000 ng·mL-1作用时达到相对表达量的峰值。与对照组相比,Bcl-2随DON浓度的增加呈现上升趋势,在达到峰值后表达下降。Bax随DON浓度增加(125、250、500 ng·mL-1),其表达略降,在1000、2000 ng·mL-1时表达增加,并在1000 ngmL-1时达到峰值,变化情况与Bcl-2相反。Bid随DON浓度的升高,其表达呈下降趋势,在2000 ng·mL-1时达到最低表达量。而Bcl-2与Bax表达量的比值显示,在500 ng.mL-1时其比值最大,随后随DON浓度增加,高剂量反而低于低剂量比值。