光皮桦BlOFPs基因的克隆及其功能研究

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光皮桦(Betula luminifera)不仅材质优良,是优先推广的珍贵树种,而且是林木遗传研究的理想材料。材质性状的改良是现阶段光皮桦育种的主要内容之一。挖掘鉴定材质性状相关的关键基因,阐明其功能,是实现光皮桦材质高效育种的重要前提。本研究在转录组测序获得的相关数据基础上,利用RACE技术从光皮桦中克隆得到7个BlOFPs基因全长。cDNA全长序列在665-1328bp之间,ORF大小在345-1062bp之间,ORF之间的一致性在24.5-61.5%之间。推测所编码的蛋白由115-354个氨基酸残基构成,氨基酸序列之间的一致性在11-50%之间,并且在C端都含有一个OVATE结构域。进化树分析显示BlOFP分布在3个分支,其中BlOFP1、BlOFP2在一个分支上,BlOFP3、BlOFP5、BlOFP7在一个分支上,BlOFP4、BlOFP6在一个分支上。利用定量PCR分析7个BlOFPs基因在光皮桦中的组织特异性表达。BlOFP1在成熟叶中的表达量明显高于其他样品,且在茎段中表达量呈现随木质化程度提高而递增的趋势。BlOFP2主要在木质化茎段中表达,且随木质化程度提高呈下降趋势。BlOFP1、BlOFP2在茎的外层组织中表达高而在内层组织中的表达低。BlOFP3、BlOFP4、BlOFP6、BlOFP7具有相类似的表达模式,均在叶片及雌花中有高丰度的表达量。BlOFP5在各器官中呈波动的表达模式,表达量差异不大。BlOFP3、BlOFP4、BlOFP5、BlOFP6在茎段的4个组织中的表达模式相似,均在韧皮部中的表达量高,而其他3个组织中的表达量相对低。在来自茎段的4个组织中,BlOFP7主要在韧皮部、形成层中表达;而在外层木质部、内层木质部中的表达量均较小。由定量PCR结果显示,BlOFP1、BlOFP2与次生生长可能有密切关系,BlOFP3、BlOFP4、BlOFP5、BlOFP6、BlOFP7可能与叶的发育及花的形成有关。原位杂交结果显示BlOFP1、BlOFP2基因在茎段横截面方向具有相类似的表达模式,主要在形成层表达,其次是在韧皮部、木质部,而在髓中几乎不表达。IAA、GA处理对BlOFP1、BlOFP2基因在茎段中的表达具有协同作用,均抑制基因的表达。BlOFP1在应拉木处理后表达量均降低,且应拉区的表达量比较对应区的下降幅度大。BlOFP2在应拉木处理后应拉区中的表达量升高,而对应区的表达量降低。为阐明BlOFP在光皮桦木材形成过程中的分子机理,对BlOFP进行酵母双杂交分析。构建的7个pGBKT7-BlOFPs载体质粒即没有毒性也没有自激活活性。构建的5个pGBKT7-BlSTMs载体质粒中pGBKT7-BlSTM2、pGBKT7-BlSTM载体质粒有自激活活性,而pGBKT7-BlSTM1、pGBKT7-BlSTM3、pGBKT7-BlSTM4载体质粒即没有毒性也没有自激活活性。杂交结果发现70个BlOFP与BlKNOX杂交组合中共7个组合有蛋白互作,分别是OFP3-KNOX2、OFP3-KNOX4、OFP3-KNOX5、OFP4-KNOX2、OFP6-KNOX2、OFP6-KNOX4、OFP6-KNOX5。酵母双杂交结果显示,BlOFP与BlKNOX可能形成功能复合体共同参与相应代谢途径。构建7个BlOFPs基因超表达载体,并对其中的BlOFP1、BlOFP2基因进行了转化光皮桦,得到转基因植株。表型观察发现转BlOFP2基因植株表现出与野生型明显不同的表观性状,植株表现为主枝不明显,分枝较多,叶片明显小于野生型。农杆菌介导的形成层细胞诱导分析发现,窗口的愈合情况对形成层组织与农杆菌接触的时间有影响,进而影响转化效率。形成层与农杆菌接触的面积是又一影响转化效率因素。以上研究结果不仅为光皮桦木材形成分子遗传基础的进一步解析奠定了基础,而且为后续分子辅助育种提供重要序列信息和基因资源。
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