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目的:为探索乙酰胆碱酯酶(AChE)水解底物强大功能的可能机制,观察底物及外周阴离子位点(PAS)抑制剂对重组在云母表面人工磷脂膜上的AChE四聚体(AChE G4)亚分子结构的影响。内容:重组于云母表面的人工磷脂膜的制备;AChE在人工磷脂膜上的重组;AChE多分子型的形态学研究;AChE G4和乙酰胆碱酯酶单体(AChE G1)的分离及纯化;ACh及抑制剂对重组于云母表面人工磷脂膜上的AChE G4结构的影响;重组于云母表面人工磷脂膜上的AChE G4结构与底物抑制作用;丁酰胆碱(BCh)对重组于云母表面人工磷脂膜上的AChE G4结构的影响。方法:冰浴超声法制备磷脂膜;囊泡融合技术将AChE重组到以云母为支撑的磷脂膜上;透射电镜(TEM)和原子力显微技术(AFM)对比观察AChE的多分子型;快速蛋白液相色谱法(FPLC)法对AChE G4和AChE G1进行分离、纯化;AFM观察ACh或propidium (PAS抑制剂) -ACh等作用前后AChE G4的亚分子结构动态改变,以及BCh对重组在人工磷脂膜上的AChE G4亚分子结构的影响。结果:制备的以云母为支撑的人工磷脂膜均匀而平坦,融合后缺陷较少,测得形成磷脂膜的厚度是( 2.3±0.3 nm, n=30 ),这是单层磷脂膜的厚度。相同浓度的大豆卵磷脂成膜性不如蛋黄卵磷脂,膜中形成的缺陷较多,粗糙度明显高于蛋黄卵磷脂形成的磷脂膜的粗糙度。在AFM的相位像中,磷脂膜的边界呈高亮显示,可看到与高度像上对应的酶蛋白均匀地镶嵌在磷脂膜上,酶蛋白比磷脂膜暗,表示酶蛋白的粘性比磷脂膜高,弹性比磷脂膜大。单个重组在以云母为支撑人工磷脂膜上的AChE G4(蛋白处于近生理条件下,非晶体状态)颗粒是边界清晰、中间突出的椭圆形球体。构成一个AChE G4颗粒的亚基之间排列紧密,未见亚基构成,蛋白平均大小为[(89±7) nm×(68±9) nm×(6±3) nm,长×宽×高,n=100]。单个重组在以云母为支撑人工磷脂膜上的AChE G1的大小为[(18±5)nm×(15±4)nm×(4.02±0.67)nm,长×宽×高, n=100]。低剂量7μM S-ACh对重组在以云母为支撑人工磷脂膜上的AChE G4亚分子结构最明显的影响是亚基排列松散,粗糙度值明显增大,亚基之间形成一个无阻碍空间,即在四聚体的中间形成一个中央通道,这与Χ-射线晶体学和分子动力学研究结果相一致,中央通道依次经小→大→小→侧门变化,单个AChE G4颗粒平均大小为[ (104±7) nm×(91±5) nm×(8±2) nm,长×宽×高, n=100],无阻碍空间大小为[(60±5) nm×(51±9) nm,长×宽,n=30],侧门口宽(52±5)nm,纵深(32±3)nm,n=10;而在PAS抑制剂存在下,ACh不能引起AChE G4亚分子结构发生变化。在50μM S- ACh作用下,AChE G4的结构出现了明显不同于7μM S-ACh引起的酶结构的变化,可看到形成了多个大小不一的环形蛋白结构,直径为350～400nm,环形结构彼此之间有连接;也有没有发生明显变化的蛋白,直径在150～170nm,没有发生变化的蛋白通常是孤立的。在125μM S-ACh的作用下,酶仍然均匀分布在磷脂膜上,但酶的大小发生了明显的变化,平均大小为[(16±2)nm×(15±1)nm×(1±0.2)nm,长×宽×高, n=100],酶的高度明显降低。与7μM S-BCh反应后,构成AChE G4的四个亚基排列也会出现松散态,酶的大小为[ (100±5) nm×(87±6) nm×(7±3) nm,长×宽×高,n=100],亚基之间形成了一个无阻碍空间,空间的大小比S-ACh作用后的要小,为[(38±4)nm×(35±2)nm,长×宽,n=30]。结论:利用AFM可观察到磷脂膜的微观形成过程为脂质体囊泡吸附→脂质体囊泡之间发生粘着→脂双层之间形成接触点→磷脂囊泡破裂→形成磷脂分子层→磷脂分子层间流动进行融合;通过AFM相位像中磷脂膜和蛋白的粘弹性差别信息以及高亮显示的膜边界可以证明囊泡融合法成功地将AChE组装到了人工磷脂膜上。根据在低剂量7μM ACh作用下,AChE G4亚分子结构的变化,我们提出了AChE实现其高效性的基本原理:AChE G4快速水解ACh的可能关键步骤为:①在正常状态下,处于紧密态的AChE G4只有两个PAS是相对暴露的,在ACh的进攻下,AChE产生强的静电场能吸引阳离子底物ACh与暴露的PAS结合,②单个亚基ACG开放,ACh进入狭隙底部,③底物被水解,④导致亚基之间瞬间斥力增大,四聚体之间形成中央通道,同时亚基之间通过变构使四个PAS均更加暴露,⑤与单个亚基活性位点结合的产物胆碱和乙酸可经亚基“后门”处到达中央通道,⑥酶分子的“侧门”开放,酶分子紧缩,⑦产物离开酶,⑧酶再恢复原态。底物ACh引起AChE G4亚分子结构的变化与其水解底物的高效性是一致的,AFM从形态学上证明了在底物ACh作用下AChE G4分子中间形成中央通道可能控制着酶的周转速度。ACh与PAS的相互作用控制着AChE G4中央通道的产生及单个亚基活性中心狭隙的开放,PAS抑制剂可阻断这种作用。在50μM ACh作用下, AChE为了达到快速水解底物的作用,形成的大的环形结构可能是由2～3个AChE G4形成的开放式通道,多个AChE G4间形成的开放式通道是与其水解底物的高效性相一致的。在125μM ACh作用下, AChE G4会发生底物抑制现象,是由于AChE G4解聚,变成了酶单体,最终导致发生底物抑制现象的是AChE的单体结构。AChE G4与7μM S-BCh作用后构成酶的四个亚基排列也会出现松散态,亚基之间形成了一个无阻碍空间,空间的大小比S-ACh作用后的要小,这可能是AChE水解BCh比水解ACh速度慢的原因之一。