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C3肾病(C3 glomerulopathy)是一类免疫荧光下特征性地表现为补体C3沉积显著,不伴或仅伴少量免疫球蛋白沉积的膜增生性肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis,MPGN)。补体系统活化异常在C3肾病、免疫复合物介导的膜增生性肾炎(immune complex mediated membranoproliferative glomerulonephritis,IC-MPGN)、非典型溶血尿毒综合征(atypical hemolytic uremic syndrome,aHUS)等补体相关性罕见肾病的发生发展中起着重要作用。遗传突变导致的补体系统异常活化在C3肾病中的致病机制近年来受到广泛关注和深入研究。然而,已有的研究多集中在高加索人群,并且研究仅是传统的突变,对筛查出来的突变也缺乏严格的致病性评估。另一方面,此类疾病表现为复杂的多因素遗传疾病,尽管有证据表明,经典遗传模式可以参与部分疾病的发生发展,然而更多病例为散发,不排除其他复杂遗传模式参与的可能性。因此,本研究旨在通过回顾性队列分析,结合临床观察、遗传分析及生物信息学预测,探讨亚洲人群C3肾病突变图谱的分布特征,并针对合子后单核苷酸嵌合突变(postzygotic single-nucleotide mosaicisms,pSNMs),检测这种体细胞突变与肾脏特异性受累之间的可能关联。第一部分:C3肾病补体途径基因的突变图谱本部分回顾性地收集了自1985年9月至2014年2月于南京军区南京总医院肾脏病研究所经肾活检明确诊断的43例C3肾病患者,包括33例C3肾炎(C3 glomerulonephritis,C3GN)和 10 例致密物沉积病(dense deposit disease,DDD),以及24例IC-MPGN患者作为对照,运用靶向外显子捕获和大规模平行测序技术,对病人的补体系统旁路途径11个候选基因进行测序。经过严格的筛查,共确定20个罕见突变:16个为文献报道突变,4个为本研究新发现突变。根据指南进行突变致病性分类定义:1个为可能致病突变(likely pathogenic,LP),余 19 个均为功能不确定突变(variants of uncertain significance,VUS)。3个突变被报道经实验证实可导致突变蛋白功能缺陷。补体CFH、CFI、CD46和C3基因的突变频率最高。在DDD、C3GN和IC-MPGN病人中,分别有50%、27%和17%的病人检测出旁路途径遗传异常改变。不论哪一类疾病,有无突变的病人之间在临床表征、疾病进展及预后方面均无统计学差异。本部分研究通过大样本遗传筛查,肯定了 C3肾病等补体相关性肾病复杂的遗传背景,促进了亚洲人群中此类疾病的研究进展。此外,精确的遗传学检测有助于提升对C3肾病致病机制的理解;对筛查出来的突变进行严格的致病性定义对于疾病临床诊断、预后和治疗均具有重要意义。第二部分C3肾病补体途径基因嵌合突变的筛查与鉴定本部分设计了严格的工作流程,对C3肾病等补体相关性罕见肾病病人的嵌合突变进行了筛查及鉴定,探讨了复杂遗传模式下嵌合突变与散发性遗传相关性肾病肾脏受累的关联,以及其可能的致病机制。运用MosaicHunter和PGM嵌合突变扩增测序技术,共检出9个候选嵌合突变。CFH基因上的错义突变c.2808G>T(rs1065489)同时在4例病人身上被检测到,利用焦磷酸测序对该突变进一步验证,结果证实在1例DDD和1例C3GN病人中为嵌合突变,嵌合比例均为5%;在另2例病人中为杂合突变。Sanger测序未能观察到嵌合突变的低峰。嵌合突变在病人肾组织、口腔颊粘膜、尿液中的比例范围为8～35%,显著高于血DNA(P<0.001),尤以肾脏为突出。Meta分析显示该突变可显著增加补体相关的自身免疫性疾病,尤其是DDD及aHUS的患病风险。生物信息学软件预测该突变对蛋白功能有害。同源建模观察到该突变位于配体连接表面,突变导致CFH蛋白和配体C3b的结合自由能下降6.55kcal/mol。本部分内容联合MosaicHunter和PASM技术,以及焦磷酸验证,显著提高了嵌合突变的检测敏感性和特异性,为非肿瘤性疾病嵌合突变的研究提供了可靠的技术路线。此外,C3肾病中肾组织高比例嵌合突变的发现提示其导致肾脏特异性受累的可能性。综上所述,本研究回顾性地收集了亚洲人群最大样本量的以C3肾病为主的补体相关性罕见肾病队列,同时检测了补体系统相关的11个基因,我们发现:1)1个可能致病突变,和19个功能不确定突变;2)补体CFH、CFI、CD46和C3基因的突变频率最高;3)在DDD、C3GN和IC-MPGN病人中,分别有50%、27%和17%的病人检测出旁路途径遗传异常改变;4)部分病人存在CFH c.2808G>T位点嵌合突变,且在肾组织DNA中的比例显著高于外周血DNA;5)Meta分析显示该突变可显著增加DDD及aHUS的患病风险;6)该突变位于CFH蛋白与配体C3b的连接表面,造成蛋白连接自由能显著降低。本研究完善了亚洲人群C3肾病的遗传图谱,拓展了补体系统遗传分子机制的范畴,有助于加深临床医生对补体系统遗传致病机制的认识,开展针对性的临床诊断与咨询。