论文部分内容阅读
目的:探究沙利度胺(Thd)对实验室内造模形成的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的预防和治疗的作用，从几种免疫性机制层面，探讨Thd对EAE模型的多方面影响。 方法:首先把体重相近的50只SD雌性大鼠随机分配为5组:正常空白对照组、EAE模型对照组、Thd药物低剂量组、Thd药物中剂量组、Thd药物高剂量组，每组均有大鼠10只。在制作模型成功后当天起，即对Thd各药物剂量组进行药物干预，分别都给以Thd药物15mg/kg.d、30mg/kg.d、60mg/kg.d相应剂量灌胃，同时以生理盐水2ml/d剂量灌胃正常空白对照组、EAE模型对照组。把粗制髓鞘碱性蛋白(MBP)混合高浓度灭活的卡介苗、完全弗式佐剂做成乳化液，从皮下部位注射，成功制作EAE大鼠动物模型，将等量完全福氏佐剂皮下注射给予正常空白对照组。在制作模型成功后，持续予以Thd各药物剂量组治疗，连续给予药物干预时间为14天。制作模型后，对各剂量组EAE大鼠每日进行神经功能的障碍评分及发病高峰期体重的测定，同时对大鼠发病的潜伏期、进展期、高峰期相应的神经功能损害评分及体重变化进行记录。若大鼠神经功能损害的临床评分连续3天不再加重、或者全部肢体瘫痪或濒临死亡，则此时作为大鼠发病的高峰期。发病的各组动物均在高峰期时处死，在造模6周后，处死未发病以及正常空白对照组动物。将各组大鼠的脑脊髓组织、脾脏组织、静脉血提前后进行相关实验室测定。使用HE染色观察大鼠脑脊髓组织在行光镜下的基本病理学组织改变。使用酶联合免疫学吸附方法(ELISA)测定血清白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)的水平。流式细胞术检测脾组织中CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例变化。提取外周血中T细胞mRNA，使用PCR技术检测影响Treg细胞分化及功能的关键转录调控蛋白FOXP3的mRNA相对表达水平。 结果:(1)各剂量组模型大鼠临床发病状况及高峰期时体重的变化:正常空白对照组的大鼠均未出现发病;EAE模型对照组大鼠发病率为80％;Thd低、中、高剂量药物治疗组临床发病率依次为60％、50％、以及40％。与无药物干预EAE模型对照组相比较，Thd各药物剂量组临床发病的潜伏期均延长(P＜0.01)，剂量越大潜伏期延长越明显，差异有统计学意义(P＜0.01)。与EAE对照组相比，Thd各剂量组疾病进展期均缩短，且随Thd剂量增加而缩短越明显，各组间差异均有统计学意义(P＜0.01)。与EAE对照组相比，Thd各剂量组神经功能障碍评分均降低，且随Thd剂量增加而降低越明显，各组间差异具有统计学意义(P＜0.01)。与EAE对照组相比，Thd各剂量组高峰期平均体重均增加，且随Thd剂量增加而增加程度越明显，各组间差异均有统计学意义(P＜0.01)。(2)各个实验组大鼠的脑脊髓病理组织学改变情况:正常空白对照组大鼠脑脊髓未发生组织病理学变化;而不同浸润程度的白质脱髓鞘改变情况均出现在EAE无干预对照组和Thd各药物剂量组，在脑和脊髓组织内的小血管旁边，炎性细胞大量聚集，形成典型的“袖套”状现象，伴随相应的血管充血。淋巴细胞是聚集细胞的主要部分，伴极少单核巨噬细胞。EAE对照组病理评分最高，Thd各剂量组评分均较EAE对照组评分下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且EAE大鼠脑组织病理学评分随Thd剂量增加而依次降低，各剂量组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。(3)EAE对照组血清中IL-4、TGF-β的含量较正常对照组低(P＜0.01);血清中TNF-α、IL-17、IL-6的含量较正常对照组高，(P＜0.01或P＜0.05);Thd各剂量组血清中IL-4、TGF-β的含量较EAE对照组明显升高(P＜0.01)，血清中TNF-α、IL-17、IL-6的含量较EAE对照组降低(P＜0.01或P＜0.05);Thd高、中剂量组血清中IL-4、TGF-β的含量较Thd低剂量组升高((P＜0.01或P＜0.05)，血清中TNF-α、IL-17、IL-6的含量较Thd低剂量组降低(P＜0.01或P＜0.05);Thd高剂量组血清中IL-4、TGF-β的含量较Thd中剂量组明显升高(P＜0.01)，血清中TNF-α、IL-17、IL-6的含量较Thd中剂量组降低(P＜0.01或P＜0.05)。(4)与正常对照组比较，EAE无干预对照组脾脏组织中出现了CD4+CD25+Treg/CD4+T比例明显的下降的现象(P＜0.01);而相比与EAE无干预对照组，Thd各药物剂量组出现了大鼠的脾脏组织细胞中CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比例明显升高的现象（P＜0.01或P＜0.05）;相比较于Thd低剂量药物组，Thd中、高剂量组出现了脾脏组织中的CD4+CD25+Treg/CD4+T比例明显升高的情况(P＜0.01);相比较于Thd中剂量药物组，Thd高剂量防治组大鼠脾组织CD4+CD25+Treg/CD4+T明显升高(P＜0.01)。(5)与正常对照组比较，EAE对照组T细胞FOXP3mRNA的表达水平明显降低(P＜0.01);与EAE对照组比较，Thd各剂量防治组大鼠T细胞FOXP3mRNA的表达水平明显升高(P＜0.01或P＜0.05);与Thd低剂量防治组比较，Thd高、中剂量组大鼠T细胞FOXP3mRNA的表达水平明显升高(P＜0.01);与Thd中剂量组比较，Thd高剂量防治组大鼠T细胞FOXP3mRNA的表达水平显著上升(P＜0.01)。(6)各实验数据相关性的分析:①各实验组大鼠发病高峰期临床神经功能损害分数，与各组大鼠脾脏组织CD4+CD25+Treg/CD4+T比例、血清中IL-4、TGF-β的水平、外周血T细胞中FOXP3mRNA表达水平呈负相关(P＜0.01或P＜0.05);与血清中TNF-α、IL-6、IL-17呈正相关(P＜0.01)。②.EAE模型对照组及各剂量组SD大鼠临床发病高峰窗口炎性细胞浸润程度评估分数，与大鼠的脾脏组织CD4+CD25+Treg/CD4+T比例、血清中IL-4、TGF-β含量水平、外周血T细胞FOXP3mRNA表达水平呈负相关(P＜0.01或P＜0.05);与血清中TNF-α、IL-6、IL-17呈正相关(P＜0.01)。 结论:1.EAE大鼠存在Th1/Th2、Treg/Th17、CD4+CD25+Treg/CD4+T失衡，导致Treg/Th17细胞平衡向Th17漂移，Th1/Th2细胞平衡向Th1漂移、CD4+CD25+Treg比例下降。2.Thd能有效促使EAE模型大鼠发病率降低、延长其发病的临床潜伏期、缩小其临床进展期、降低临床神经功能损害分数和炎性细胞组织浸润严重程度，提示THD对EAE模型动物大鼠的疾病的发生存在防治作用。3.Thd对EAE大鼠的疾病发生发展的防治影响，是通过纠正Th1/Th2、Treg/Th17失衡、提高CD4+CD25+Treg/CD4+T比例三个途径实现的。