氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯(Graphene,GN)的氧化衍生物,因具有丰富的含氧功能团而易于表面功能化修饰,功能化的氧化石墨烯在生物传感器的制造和骨组织工程的应用正在扩大。然而,当前报道对氧化石墨烯的RGD肽功能化修饰需要引入第三种链接分子,不但增加了实验体系的复杂性,而且有可能改变氧化石墨烯自身的物理化学性能。因此,提供一种更为直接、简单的方法实现氧化石墨烯表面生物功能化,并研究其生物性能显得很有必要。RGD肽也被称为细胞粘附肽,能够促进细胞粘附、增殖和分化。RGD肽与GO的结合能否增强细胞的活性、能否作为细胞生物传感器界面应用于体外细胞学分析、能否应用于骨组织工程,值得我们去研究探索。目的:1、通过EDC/NHS耦合反应将RGD肽共价修饰GO,合成一种新型的RGD-GO生物膜,并对其进行表征;通过RGD-GO生物膜修饰ITO电极作为传感电极,研究其在电化学生物传感器的应用;2、研究RGD-GO生物膜促进C3H10T1/2干细胞体外成骨分化的能力;3、考察RGD-GO生物膜体内生物相容性;4、研究RGD-GO生物膜复合c3h10t1/2干细胞裸鼠皮下异位成骨的能力,将其在骨组织工程中的应用进行初步的探索。方法:1、将go水溶液通过自然干燥形成go薄膜,通过edc/nhs耦合反应,将具有胺功能团的rgd肽固定在go膜表面,形成rgd-go生物膜。原子力显微镜对修饰前后go表面进行形貌学表征,傅里叶变换红外光谱测量修饰前后go化学成分变化,接触角测量仪对合成材料的亲疏水性进行测量。同时,rgd-go生物膜表面电化学性质通过电化学阻抗谱(eis)进行表征。2、分别在rgd-go生物膜/go膜上培养人牙周膜成纤维细胞(hpdlfs),cck8检测比较细胞活力,激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架情况,通过imagej软件(nih)分析细胞在两种材料表面的粘附差异;将rgd-go生物膜修饰在ito电极表面,显微镜下观察培养在rgd-go生物膜修饰的ito电极表面hpdlfs的生长情况,通过电化学阻抗谱技术(eis)检测和对比分析hpdlfs细胞在rgd-go生物膜/go膜修饰电极表面的增殖粘附行为,通过eis检测脂多糖对hpdlfs细胞活力的影响,并以cck-8实验做为对照。3、以c3h10t1/2为干细胞模型,在rgd-go生物膜表面培养不同时间后,通过显微镜观察材料表面细胞的生长形态、激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架情况;通过检测碱性磷酸酶活性、碱性磷酸酶染色实验、茜素红染色实验、荧光定量pcr检测成骨相关基因opn、ocn、runx2的表达,考察在rgd-go生物膜上培养的c3h10t1/2干细胞在未加成骨诱导因子的情况下成骨分化的能力;4、以临床常用植骨材料bio-oss为对照、将rgd-go生物膜同期植入sd大鼠背部皮下,通过大体观察和形态组织分析,对比研究rgd-go生物膜的体内生物相容性;5、rgd-go生物膜复合c3h10t1/2干细胞植入裸鼠背部皮下,以临床常用植骨材料bio-oss为对照,通过大体观察、he染色、masson染色、免疫组化染色,考察其异位成骨能力。结果:1、与go膜相比,rgd-go生物膜线粗糙度和面粗糙度增加,亲水性提高,ft-ir检测发现,rgd-go生物膜1732cm-1的羧基(c-oh)吸收峰减弱,增加了1533cm-1和1290cm-1两处吸收峰,而该两个波数吸收峰分别对应rgd肽的酰胺i和酰胺ii的特征峰;电化学性质检测发现:rgd肽共价修饰在go表面后,rct值从2.1e4Ω增加至4.7e4Ω,cpe-t值进一步增加至5.3e-6c。2、hpdlfs在两种膜表面的细胞活力都随着培养时间延长逐渐增加,但在rgd-go生物膜上呈现更高的增殖能力(p<0.05)。激光共聚焦显微镜下显示:rgd-go生物膜表面细胞密度值显著高于go膜表面细胞密度值,rgd-go生物膜表面细胞铺展面积显著高于go膜表面的细胞平均面积(p<0.05)。显微镜下显示hpdlfs能够培养在rgd-go生物膜修饰的ito电极表面;其粘附增殖的电化学阻抗分析测量显示:随着hpdlfs在rgd-go生物膜修饰的ito电极表面的粘附和增殖,ccell在2h~24h迅速降低,细胞铺展形成细胞单层时,ccell稳定在8.2~8.5nf(72h),略高于hpdlfs在go修饰的ito电极表面的7.6~8.1nf;hpdlfs在rgd-go生物膜修饰的ito电极表面增殖中的rcell值持续增大,形成细胞单层(72h)时rcell值达到最大,约为1382Ω,在hpdlfs增殖过程中(24h及48h),细胞在rgd-go生物膜修饰ito电极表面的rcell值高于细胞在go修饰ito电极表面的rcell值;hpdlfs细胞在rgd-go生物膜修饰ito电极表面增殖过程中r′s持续增大,在接种72h后达到最大值(~338Ω),且增殖过程中r′s值均高于hpdlfs细胞在go修饰ito电极表面增殖过程中的r′s值。这些结果与细胞计数结果相吻合。以rgd-go生物膜为电化学阻抗谱检测界面的细胞生物传感器来研究lps对hpdlfs细胞增殖的影响,电化学阻抗谱检测结果与cck-8测定的结果相似。3、c3h10t1/2细胞接种在rgd-go生物膜表面后,显微镜和激光共聚焦均显示:rgd-go生物膜能够支持细胞粘附伸展并促进细胞粘附增殖。与go相比,rgd-go生物膜表面细胞分别在培养3天、5天、7天、9天时碱性磷酸酶活性持续增高(p<0.05),培养9天后碱性磷酸酶染色呈现阳性,培养14天后茜素红染色阳性;在培养9天后成骨相关基因opn、ocn、runx2的表达水平显著高于go组和对照组(p<0.05)。4、rgd-go生物膜植入sd大鼠皮下2周、4周、8周、12周后,与bio-oss骨支架材料一样均未见炎症细胞和异物巨噬细胞,而且植入材料与组织界限逐渐清晰,由最初的薄层纤维样物到形成纤维膜样物、周围纤维组织逐渐增厚,植入皮下材料范围逐渐减小。5、裸鼠皮下植入8周后he染色、masson染色结果显示复合了干细胞的bio-oss/rgd-go均为阳性,免疫组化分析可见成骨的基质或骨样组织。结论:1、本实验成功的合成了rgd-go生物膜,所获得的rgd-go生物膜具有好的稳定性和特殊的电化学特征,能够作为新型的细胞传感器界面实现细胞体外电化学检测分析。2、rgd-go生物膜具有良好的体外生物相容性,具有增强细胞粘附增殖、诱导干细胞成骨分化的能力,在未加成骨诱导液的前提下可以实现C3H10T1/2干细胞的成骨分化。3、RGD-GO生物膜具有良好的体内生物相容性;体内异位成骨实验表明复合了C3H10T1/2干细胞的RGD-GO生物膜可以成骨。本实验通过一种直接、简单的方法实现了GO表面生物功能化,通过一系列表征、EIS检测分析,为RGD共价结合氧化石墨烯生物膜作为细胞生物传感器的传感界面提供了实验基础;通过体内外生物相容性、体外成骨分化、体内异位成骨实验,为后期研究电刺激下促进成骨分化加强、牙周再生的可能性、作为生物膜覆盖在仿生骨支架材料表面加强成骨分化提供了一定的应用参考依据。