帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元选择性缺失,残存的神经元内出现以α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）异常聚集为主形成的路易小体（Lewy bodies,LBs）。近年来,越来越多的证据表明铁是PD发病的一个关键因素,PD患者和动物模型脑内黑质区均有大量铁的沉积,并且残存的多巴胺能神经元内铁含量也明显升高。PD中铁选择性沉积的机制尚未完全阐明,本实验室前期工作证实,二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter 1,DMT1）表达异常升高,可能参与了 PD中黑质区铁的沉积。PD的特征性病理标志LBs中也包含有铁。作为LBs的主要成分,α-Syn异常聚集会进一步加剧细胞内铁水平的升高,并且α-Syn被证实为一种铁还原酶,能够将细胞内的Fe3+还原成Fe²⁺,其表达异常必然会影响细胞内铁代谢,但是α-Syn如何影响脑内铁稳态以及在黑质铁沉积中的作用尚不明确。我们发现在高表达野生型α-Syn（wild-type α-synuclein,WT α-Syn）和 A53T 突变型 α-Syn（A53T α-synuclein,A53T α-Syn）的SH-SY5Y细胞中,DMT1 mRNA水平不变,蛋白水平升高。那么,α-Syn是通过什么机制导致DMT1蛋白表达水平升高的呢?对于该问题的阐明对于揭示PD中铁代谢紊乱以及黑质区铁沉积的机制具有重要意义。研究证实泛素蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system,UPS）是维持DMT1蛋白稳定性的重要途径。UPS主要包括两个过程:一是靶蛋白的泛素化,二是蛋白酶体的降解。Parkin作为DMT1特异性的E3泛素连接酶,可介导DMT1的泛素化降解,保护细胞免受铁的毒性损伤。但是parkin发生亚硝基化、磷酸化等翻译后修饰会影响其E3泛素连接酶的功能以及对底物的降解,加速神经退变。26S蛋白酶体是一种多亚基复合物,由19S调节颗粒识别泛素化蛋白,然后将其去折叠运送至20S核心颗粒中降解,其中β1、β2和β5亚基具有蛋白水解酶活性,分别对应为半胱天冬酶样、胰蛋白酶样和糜蛋白酶样活性,是执行蛋白质降解的场所。此外,真核生物细胞内还存在另一种形式的蛋白酶体—免疫蛋白酶体,β1i、β2i和β5i分别替代β1、β2和β5亚基组装到核心颗粒中,在抗原提呈和蛋白质降解方面发挥重要作用。在PD中已经报道存在UPS功能障碍,并且α-Syn异常聚集会进一步抑制泛素蛋白酶体的功能,给予蛋白酶体抑制剂处理会诱导细胞高表达DMT1。那么,在PD中α-Syn是否通过影响DMT1的泛素蛋白酶体降解途径,进而上调其蛋白表达,导致细胞内铁代谢紊乱的呢?为了探讨在PD中α-Syn对DMT1蛋白稳定性的调控机制,本实验拟从泛素化修饰和蛋白酶体降解过程开展研究。选用α-Syn高表达的SH-SY5Y细胞和携带人A53T突变型α-Syn的转基因小鼠,首先检测α-Syn对DMT1表达水平的影响,并通过检测细胞摄铁功能以及氧化应激相关指标线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm）和活性氧物质（reactive oxygen species,ROS）的变化来进行功能实验的验证。其次研究泛素化修饰环节,应用泛素化实验检测α-Syn高表达对DMT1泛素化水平的影响;应用western blot技术检测parkin Ser131磷酸化水平的变化,并通过泛素化实验检测parkin Ser131磷酸化对DMT1泛素化水平的影响。最后研究蛋白酶体降解环节,将高表达α-Syn的SH-SY5Y细胞进行转录组测序,筛选出差异基因和富集的信号通路;然后分别给予蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹,应用western blot技术检测DMT1蛋白水平的变化;应用特异性荧光多肽底物检测蛋白酶体的水解酶活性,并给予rolipram增强蛋白酶体活性后再检测DMT1的蛋白水平;应用real-time PCR和western blot技术检测蛋白酶体亚基的表达水平。结果如下:一、PD中α-Syn抑制DMT1的泛素化修饰1.高表达WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞中,与空载组相比,DMT1 mRNA水平无显著差异（P>0.05）,而DMT1蛋白表达水平分别升高了 59.1%和66.9%,差异具有高度统计学意义（P<0.01）。此外,12月龄和15月龄α-SynA53T+/+小鼠黑质区,与同窝野生型小鼠相比,DMT1的蛋白水平分别升高了 36.2%和40.9%,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.高表达WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞中,细胞的摄铁能力显著增强,与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,WT α-Syn和A53T α-Syn高表达可加剧Fe²⁺诱导的ΔΨm降低,与单独Fe²⁺处理组相比,分别降低了 2.36倍和2.52倍,差异具有统计学意义（P<0.05）。WT α-Syn和A53T α-Syn高表达还可加剧Fe²⁺诱导的ROS生成增加,与单独Fe²⁺处理组相比,分别升高了46.6%倍和50.4%,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.在HEK293T细胞中分别转染Flag空载体/HA空载体/Myc-DMT1、Flag空载体/HA-Ub/Myc-DMT1、Flag-WT α-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1 和 Flag-A53Tα-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1。与Flag 空载体/HA-Ub/Myc-DMT1 组相比,Flag-WTα-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1 组和Flag-A53T α-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1 组泛素化水平明显降低。4.高表达WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞中,与空载组相比,parkin Ser131磷酸化水平分别升高了 42.6%和43.9%,差异具有统计学意义（P<0.05）。将 S131A parkin 转染 SH-SY5Y 细胞后,WT α-Syn 和 A53T α-Syn 对 parkin 的磷酸化作用消除。此外,9月龄和12月龄α-SynA53T+/+小鼠黑质区,与同窝野生型小鼠相比,parkin Ser131磷酸化水平分别升高了 32.2%和30.9%,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.在HEK293T细胞中分别转染EGFP空载体/HA空载体/Myc-DMT1/Flag-S131A parkin、EGFP 空载体/HA-Ub/Myc-DMT1/Flag-S 131A parkin、EGFP-WT α-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1/Flag-S 131A parkin 和 EGFP-A53T α-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1/Flag-S 131A parkin,结果显示,与 EGFP 空载体/HA-Ub/Myc-DMT1/Flag-S 131A parkin 组 相 比,EGFP-WT α-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1/Flag-S 131A parkin 组 和 EGFP-A53T α-Syn/HA-Ub/Myc-DMT1/Flag-S 131A parkin 组泛素化水平明显回升。6.高表达WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞中,与空载组相比,p38 MAPK磷酸化水平分别升高了 65.6%和73.8%,差异具有统计学意义（P<0.05）。加入p38 MAPK抑制剂SB203580处理后,可显著抑制p38 MAPK的激活,并且parkin Ser131磷酸化水平也出现降低,与单独WT α-Syn和A53T α-Syn转染组相比分别降低了 25.6%和27.9%,差异具有高度统计学意义（P<0.01）。此外,9月龄和12月龄α-SynA53T+/+小鼠黑质区,与同窝野生型小鼠相比,p38 MAPK磷酸化水平也分别升高了 32.2%和35.1%,差异具有统计学意义（P<0.05）。二、PD中α-Syn抑制DMT1经蛋白酶体降解1.高表达WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞进行转录组测序,得到的原始数据经过质量控制后,与人类参考基因组序列比对率最低为94.93%,最高为95.55%,并且比对到外显子的含量最高。通过计算差异基因变化倍数以及显著性检验,共得到1047个差异基因,其中与泛素蛋白酶体表达相关的基因（如PSMB8、PSMB9、PSME1、P1P2UBC、UBA7、UBE2L6等）在α-Syn高表达组显著下调,并且差异基因富集的信号通路也与蛋白酶体途径关联。2.高表达WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞中,给予200 nM MG132处理24 hrs,可明显加剧α-Syn引起的DMT1蛋白水平的升高,与单独WT α-Syn和A53T α-Syn转染组相比,DMT1蛋白水平分别升高了 27.6%和28.1%,差异具有统计学意义（P<0.05）。给予30 μM氯喹处理24 hrs,与单独WT α-Syn和A53Tα-Syn转染组相比,DMT1蛋白水平无显著差异（P>0.05）。3.高表达 WT α-Syn 和 A53T α-Syn 的 SH-SY5Y 细胞中以及 12 月龄α-SynA53T+/+小鼠黑质区,与对照组相比,蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱天冬酶样活性均降低,差异具有高度统计学意义（P<0.01）。4.高表达 WT α-Syn 和 A53T α-Syn 的 SH-SY5Y 细胞中,给予 10 μM rolipram 处理24 hrs,蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱天冬酶样活性显著增强,差异具有高度统计学意义（P<0.01）。并且经rolipram处理后可明显拮抗α-Syn对DMT1蛋白表达的上调作用,与空载组相比降低了 30.3%,与WT α-Syn组相比降低了 38.6%,与A53T α-Syn组相比降低了 40.1%,差异具有高度统计学意义（P<0.01）。同样地,0.05 mg/kg rolipram腹腔注射21天后,α-SynA53T+/+小鼠黑质部位蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱天冬酶样活性显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。并且经rolipram处理后α-SynA53T+/+小鼠黑质部位DMT1的蛋白表达水平降低了 51.9%,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。5.高表达WT α-Syn的SH-SY5Y细胞中,与空载组相比,β1i、β5i、PA28α和PA28β的mRNA水平分别降低了 34.7%、43.8%、30.2%和28.9%,蛋白水平分别降低了46.1%、47.4%、30.1%和37.5%,差异具有统计学意义（P<0.05）。高表达A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞中,与空载组相比,β1i、β5i、PA28α和PA28β的mRNA水平分别降低了 59.2%、40.8%、37.5%和38.6%,蛋白水平分别降低了62.5%、53.1%、39.3%和34.6%,差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,9月龄和12月龄α-SynA53T+/+小鼠黑质区,与同窝野生型小鼠相比,β1i的蛋白水平分别降低了 25.2%和34.9%,PA28β的蛋白水平分别降低了 31.6%和37.6%,差异具有统计学意义（P<0.05）。6.高表达WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y细胞中,与空载组相比,26S蛋白酶体调节颗粒亚基Rpn11、Rpn10、Rpn13、Rpt1-6以及核心颗粒亚基β 1、β2、β5的mRNA水平无显著差异（P>0.05）。综上所述,PD中α-Syn对DMT1蛋白表达的调控,一方面通过激活p38 MAPK,导致parkin Ser131发生磷酸化修饰,从而抑制parkin的E3泛素连接酶活性,DMT1的泛素化水平减弱;另一方面,α-Syn通过抑制蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱天冬酶样活性以及免疫蛋白酶体亚基的表达水平,从而抑制DMT1经蛋白酶体途径降解。PD中α-Syn高表达对DMT1蛋白水平的上调作用,可显著增强细胞的摄铁功能,加剧Fe²⁺诱导的ΔΨm的降低以及ROS生成的增加,从而加重神经元的氧化应激损伤。本实验从泛素化修饰和蛋白酶体降解过程研究了 PD中α-Syn调控DMT1蛋白稳定性的分子机制,揭示了在PD中异常聚集的α-Syn可能通过上调DMT1的蛋白表达,进而导致多巴胺能神经元摄铁能力增强,铁代谢紊乱,加重氧化应激损伤。本研究为进一步阐明PD中α-Syn影响脑内铁稳态,参与黑质铁沉积提供了新的思路。