开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要标志,该过程同时受环境因素和内源信号的影响,是一个由多基因参与的复杂生物学过程。MADS-box转录因子在植物花发育过程中起着至关重要的作用,其中APETALA1(AP1)是一个典型的MADS-box转录因子,是研究植物花发育的热点基因之一。花发育过程在模式植物拟南芥中的研究较为成熟,但在多年生木本植物中的研究相对较少。白桦(Betula)属于具有非完全花的多年生木本植物,其花器官组成及结构与具有典型完全花的拟南芥相比具有明显的不同,因此,研究BpAP1调控白桦花发育的分子机制对揭示具有非完全花的木本植物的花发育过程具有重要的借鉴意义。本研究团队早期获得了能够提早开花结实的35S::BpA如转基因白桦,为了进一步揭示BpAP1调控白桦花发育的分子机理,以35S::BAP1转基因白桦及野生型白桦为试材开展了本项研究,研究结果如下:(1)以正处于成花转变关键阶段的35S::BpAP1转基因白桦的侧枝茎尖为试材进行转录组测序,分析结果发现,过表达BpAP1能够影响许多花发育相关基因的差异表达,尤其对B类MADS-box基因具有显著的影响。采用基于数学算法的模型对35S::BpAP1过表达白桦共有的差异表达基因进行了 BpAP1下游靶基因的预测,并且构建了 BpAP1介导的基因调控网络,B类MADS-box基因BpDEF被预测为BpAP1在白桦雄花序形成过程中的关键靶基因。本研究团队的前期研究结果表明,另一个B类MADS-box基因BpPI也可能是BpAP1下游调控的关键靶基因。因此,最终预测BpDEF和BpPI可能为BpAP1下游调控的关键靶基因。(2)为了验证BpDEF和BpPI是否为BpAP1直接调控的靶基因,首先对35S::BpAP1-BFP转基因白桦进行了染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,ChIP-PCR及ChIP-qPCR的结果表明,BpAP 1能够直接结合到BpDEF和BpPI的启动子上;酵母单杂交(Y1H)及烟草的瞬时转化实验结果表明,BpAP1通过直接结合BpDEF和BpPI启动子上的CArG box元件对其进行表达调控。(3)通过白桦的遗传转化获得了 17个35S::BpDEF转基因白桦株系(D1-D17)和6个BpDEF-RNDE转基因白桦株系(iD1-iD6),研究发现,35S::BpDEF转基因白桦D1株系呈现出提早开花的现象,但该雄花序不能正常发育,随着雄花序的发育而逐渐衰败脱落。连续多年观察BpDEF转基因白桦的开花模式发现,35S::BpDEF转基因白桦D1株系仅能形成雄花序而不能形成雌花序,BpDEF-RNAi转基因白桦iD6株系仅能形成雌花序而不能形成雄花序,以上研究结果表明:BpDEF可能参与白桦的性别分化,尤其在白桦雄花序的形成过程中起着至关重要的作用。因此,我们推测BpAP1可能通过直接调控BpDEF的表达来促进白桦雄花序的形成。(4)通过白桦的遗传转化获得了 5个35S::BpPI转基因白桦株系(P1-P5)和7个BpPI-RNAi转基因白桦株系(iP-iP7),研究发现,35S::BpPI转基因白桦的营养生长显著低于BpPI-RNAi转基因白桦和非转基因对照白桦,主要表现为植株矮、叶片小。通过持续多年对BpPI转基因白桦的花发育情况观察发现,过表达BpPI可能导致白桦延迟开花。进一步对BpPI转基因白桦进行转录组测序分析,结果表明,过表达BpPI能够抑制开花促进因子BpAP1、LFY、BpMADS4以及BpMADS5等基因的表达,同时促进开花抑制因子FLC的表达,因此我们推测BpPI可能主要通过抑制开花促进因子的表达来延迟白桦开花。(5)对BpAP1及其关键靶基因间的调控及互作关系进行研究发现,BpPI和BpDEF能够形成异源二聚体来直接抑制BpAP1的表达;另外,BpDEF和BpPI之间也存在直接或间接的调控关系;BpAP1、BpPI和BpDEF基因本身也存在自调控作用。酵母双杂交的结果表明,BpAP1与BpPI能够形成异源二聚体,BpAP1及BpPI还能分别形成同源二聚体;而BpDEF既不能与BpAP1形成异源二聚体,且其自身也不能形成同源二聚体。以上研究结果表明,BpAP1与关键靶基因BpDEF和BpPI间存在十分复杂的调控及蛋白互作关系,它们可能与其它MADS-box家族成员形成更为复杂的基因调控网络,进而共同调控白桦的花发育过程。综上所述,本研究通过35S::BpAP1转基因白桦的转录组测序结果预测了 BpAP1下游调控的关键靶基因,围绕BpAP 1及其关键靶基因BpDEF和BpPI开展了一系列的研究,包括BpAP1关键靶基因的验证、关键靶基因的功能研究、BpAP1及其关键靶基因间的调控及互作关系研究,本研究获得的实验结果为揭示白桦花发育的分子调控机理提供了理论依据,同时为具有非完全花的木本植物的花发育研究提供了新的线索。