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目的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是肿瘤的重要耐药机制,是肿瘤化疗失败的主要原因。在人类耐药肿瘤细胞中,几种转运蛋白:P-g蛋白(P-glyeoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-accosiated protein,MRP1～7)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein ,BCRP)与MDR有关,它们为药物排泵,可以导致胞内的细胞毒药物浓度降低,使肿瘤细胞对多种药物产生耐药。乳腺癌细胞中表达BCRP基因则可直接导致细胞耐药性的产生,因此,阻断BCRP基因的达可逆转乳腺癌耐药细胞的耐药性。RNA干扰(RNA interference ,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(post transcriptional gene silencing ,PTGS)。利用RNA干扰技术可设计出针对BCRPmRNA的SiRNA序列、阻断基因表达、逆转耐药性,可望成为肿瘤基因治疗的新手段。因此,设计、构建BCRP特异的RNAi表达体系,分析表达体系对乳腺癌耐药细胞的耐药性的影响,对肿瘤化疗提供新的途径具有重大意义。方法第一部分:针对BCRPmRNA序列,设计、筛选、合成三条SiRNA相关基因片段(BCRP1,BCRP2,BCRP4),构建出SiRNA的表达载体pGenesil-BCRP-SiRNA-EGFP,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。第二部分: 1)脂质体法转染MCF-7/ADR细胞,G418筛选得阳性克隆。2)半定量RT-PCR和Western-Blot验证SiRNA阻断BCRP基因表达的效率。3)应用MTT法分析MCF-7/ADR的IC50的变化。④筛选出最佳效率的干扰链。结果1)成功构建出针对BCRPmRNA序列的三种SiRNA载体pGenesil-BCRP1-SiRNA-EGFP, pGenesil-BCRP2-SiRNA-EGFP, pGenesil-BCRP4 -SiRNA-EGFP。2)脂质体法转染MCF-7/ADR细胞,G418筛选得各自阳性克隆。3)半定量RT-PCR和Western-blot检测各组BCRP-mRNA及BCRP蛋白的表达,各组干扰链的阻断效果不一,BCRP1组的BCRP-mRNA表达抑制率为30.3%,蛋白表达抑制率为65.6%,与对照组及BCRP2,BCRP4组差别有统计学意义(p<0.05)。4) MTT法分析各组IC50的变化,BCRP1组的IC50明显低于其他组,差别有统计学意义(p<0.05)。结论1)应用表达载体法成功构建BCRP基因特异的SiRNA干扰表达体系pGenesil-EGFP-SiRNA。2) pGenesil-EGFP-SiRNA经脂质体法转染入靶细胞后能够发挥基因沉默作用,但不同链的干扰效果不一,以BCRP1组的干扰效果最佳。3) pGenesil-EGFP-SiRNA经脂质体法转染入靶细胞后,靶细胞的耐药性发生明显变化,不同干扰链的干扰效果不一,以BCRP1组的干扰效果最佳。4)为肿瘤化疗提供理论和实验依据。