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机体是由数以亿万计分子量大小不等的分子组成。蛋白质和核酸是体内主要的生物大分子。核酸是遗传信息的载体,是生物物种延续、物种进化的决定因素:蛋白质担负着各种生理功能,是生物性状的直接表达者。它在人体代谢中扮演极为重要的角色,从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行,人类绝大多数疾病都是由蛋白质异常引起的。因此核酸与蛋白质的定量分析在生命科学、生化药物、食品分析及临床检验中都有着重要作用。深入研究小分子物质与核酸和蛋白的作用,建立核酸,蛋白快速简便的分析方法,对分子水平上阐明生命的奥秘、开发新型药物、攻克许多疑难病症以及促进信息科学的发展都具有重要的意义,是当前生物分析化学研究的前沿和热点。
本文致力于寻找新的核酸和蛋白质探针,以建立灵敏的定量检测的方法,以荧光和共振光散射技术为主要研究手段。同时应用吸收光谱技术,表面张力测定技术,电势电泳技术,透射电子显微技术等手段进行了机理研究和讨论。本文共五部分。第一部分综述了核酸和蛋白质发光探针的基本原理、研究进展、发展趋势。
在论文的第二部分,我们以Eu<3+>-BA的配合物为探针建立了灵敏的核酸分析方法。研究表明,在CTMAB存在下,核酸的加入能显著增强Eu<3+>-BA配合物中Eu<+3>的荧光,且荧光增强程度与核酸的浓度在一定范围内成正比。在最佳实验条件下,fsDNA、ctDNA和RNA的线性范围分别为1.0×10<9>-5.0x10<-6>g/mL、3.0x10<-9>-1.0×10<-6>g/mL和8.0x10<-9>-1.0×10<-6>g/mL。它们的检出限分别为0.33、0.2l和0.99ngmL。该方法用于实际样品拟南芥中DNA含量的测定,结果令人满意。机理研究表明,CTMAB与DNA所形成的离子聚合物为Eu<3+>-BA配合物提供了疏水的微环境,从而使其荧光增强。另外,我们推测形成Eu<3+>-BA配合物之后多余的BA分子可以通过疏水作用进入到CTMAB与DNA所形成的离子缔合物中,并通过分子间作用力将能量转移给Eu<3+>离子。所以我们认为,体系的荧光增强源于疏水微环境的形成和分子间能量转移。
论文的第三部分中,Tb<3+>-BA配合物被用作蛋白质的荧光探针,研究了蛋白质与配合物间的作用机理。实验表明,在SDBS存在下,蛋白质的加入能显著增白质的测定。BSA、EA和HSA的检出限分别为3.9xlO<-9>g/mL、4.0×10<-9>g/mL和8.5×10<-9>/mL机理研究认为BSA-SDBS为Tb<3+>-BA配合物提供的疏水环境能够减少配合物与水分子之间的碰撞而导致的能量损失,因而有利于体系荧光的增强。另外,过量的BA也可能通过分子间能量转移将能量传递给Tb<3+>离子,从而进一步增强体系的荧光。 在论文的第四部分,我们报道了一个用金属配合物作共振光散射探针测定蛋白质的Y<3+>-TTA-BSA-SLS新体系。实验指出,在pH为7.50的Tris-HCl缓冲溶液中,BSA和SLS可以增强Y<3+>-TTA体系的共振光散射强度。体系共振光散射强度增强的程度在一定范围内与蛋白质的浓度成正比,可用于蛋白质的测定。BSA、HSA和EA的检出限分别为5.4、5.0和6.7ng/mL。该方法已用于实际样品的测定,并取得了满意的结果。研究认为,带正电荷的Y<3+>-TTA的配合物能与带负电的BSA和SLS形成一个大的离子缔合物从而导致共振光散射强度的增强。
在论文的第五部分,研究了Al<3+>和BSA的相互作用。在pH为5.75的HMTA缓冲溶液中,Al<3+>和BSA的溶液混合后形成了大的聚集体,从而导致较强的光散射强度,且光散射的强度与蛋白质的浓度在一定范围内成正比,该法可用于蛋白质的测定。BSA、HSA和EA的线性范围分别为8.0X10<-8>-1.0X10<-5>g/mL、1.0XlO<-7>-1.0X10<-5>g/mL和1.0X10<-7>-1.0X10<-5>g/mL。
本论文的主要特点是:
在已报道的核酸及蛋白质的测定体系中,其探针大多为染料。本论文主要以金属离子及配合物作为发光探针来测定生物大分子。
1.以三种稀土-β-双酮配合物为探针,分别利用荧光和共振光的方法定量测定核酸和蛋白质,实验证明这些方法简便、快速,且有较高的灵敏度。
2.建立了以金属离子Al<3+>为探针定量测定蛋白质的简便的光散射方法,该方法的建立还为直接研究某些无机离子与生物大分子的相互作用提供有益的借鉴。
3.本文以分析化学,分子生物学为研究背景,利用荧光技术、光散射技术、吸收光谱技术、电视显微电泳技术以及透射电子显微技术等手段研究了体系作用的机理。述研究为蛋白质和核酸的检测提供了新的灵敏发光探针。