论文部分内容阅读
前言椎间盘的退变是椎间盘突出的基础，研究发现退变的椎间盘内细胞密度逐渐下降，而椎间盘细胞凋亡是细胞数量下降的重要原因。软骨终板是椎间盘的重要组成部分，它在髓核的营养交换和椎间盘的应力缓冲保护等方面起着重要作用。近年来的研究证实软骨终板的钙化所导致椎间盘营养障碍是椎间盘退变的始动因素，软骨终板的钙化早在幼年期就已发生。软骨终板细胞凋亡引起软骨终板钙化，因此在椎间盘的退变中软骨终板细胞凋亡起着重要的作用。本试验在解剖显微镜下将正常及退变颈间盘标本分成软骨终板、纤维环、髓核各组，应用免疫组化(SABC)方法检测各组中Bcl2、Fas、Sox9蛋白产物的表达情况，并对免疫产物进行计算机显像系统图像分析，从而探讨凋亡相关基因Bcl2、Fas、Sox9在退变间盘各部分的表达情况及意义。实验材料和方法1、主要试剂及仪器试剂：Bcl2单克隆抗体、Fas单克隆抗体、Sox9单克隆抗体、链酶亲和素-过氧化物酶复合物法(SABC)免疫组化即用型试剂盒及DAB(联苯二胺)显色液(博士德生物化学试剂公司，武汉)。多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，sigma公司)；二甲苯；各浓度梯度酒精仪器：Leitz1512型切片机(Leitz，German)；BX60F／PM30-3型显微照相系统(Olympus，，Japan)；Metamorph(NIC，U.S.A.)／DP10／BX51(Olympus，Japan)彩色病理图文分析系统：电子天平；微量移液器2、实验取材及实验分组①实验取材实验组标本30例均为中国医科大学附属盛京医院2005.1-2006.1住院行颈椎病手术所取出新鲜椎间盘，经病理证实为退变椎间盘(其中男女各15例，患者年龄为40-50岁，所有标本均为C4-5间盘)；正常对照组标本30例取自颈椎外伤行椎管减压术患者，所取椎间盘组织经病理学证实为正常椎间盘组织。(患者男19例，女11例，年龄均为20-30岁，所有标本均为C4-5间盘)。取材后在生理盐水中迅速漂洗去除血渍和污物，各标本在解剖显微镜下分为软骨终板、纤维环及髓核三部分后分别放入浓度为4％的多聚甲醛溶液固定24小时，石蜡包埋。②实验分组实验分为正常对照组和异常实验组，每大组再各分为软骨终板、纤维环及髓核三小组3、实验方法、检测指标及染色结果的判断标准(1)实验方法、检测指标：①HE染色进行形态学观察。②免疫组织化学法(SABC法)检测Bcl2、Fas、Sox9的表达情况。③免疫反应切片在BX60F／PM30-3型显微照相系统(0lympus，，Japan)下观察并摄像④图片应用Metamorph(NIC，U.S.A.)／DP10／BX51(Olympus，Japan)彩色病理图文分析系统进行免疫反应产物显微图像分析，得出平均光密度值和积分平均光密度值(2)染色结果的判断标准本实验用DAB显色，Bcl2、Fas、Sox9位于胞浆中，阳性反应表现为胞浆黄色(弱阳性)或棕褐色(强阳性)，苏木精复染后胞核为蓝色，胞浆染色不变。4、数据分析用SPSS统计软件进行数据处理，计算各指标的均数和标准差，用单方差分析法分析总体差异及各组间及各组内差异。实验结果1、形态学结果(1)在正常组颈间盘软骨终板、纤维环及髓核免疫组化反应切片中，每张切片40×10倍显微镜下任选5个视野摄像。(见图1-6及图13-15)分别统计Bcl2、Fas、Sox9在每100个视野中强阳性、弱强阳及阴性表达所占比例：①Bcl2在正常软骨终板、正常纤维环、正常髓核中阳性表达所占比例数高于阴性表达所占比例数，且Bcl2在正常软骨终板中强阳性表达所占比例数高于在正常纤维环和正常髓核中强阳性表达所占比例；②Fas在正常软骨终板、正常纤维环、正常髓核中阴性表达所占比例数高于阳性表达所占比例数，且Fas在正常软骨终板中阴性表达所占比例数低于在正常纤维环和正常髓核中阴性表达所占比例数；③Sox9在正常软骨终板、正常纤维环、正常髓核中阳性表达所占比例数高于阴性表达所占比例数，且Sox9在正常软骨终板中强阳性表达所占比例数高于在正常纤维环和正常髓核中强阳性表达所占比例。(2)在异常组颈间盘软骨终板、纤维环及髓核免疫组化反应切片中，每张切片40×10倍显微镜下任选5个视野摄像。(见图7-12及图16-18)分别统计Bcl2、Fas、Sox9在每100个视野中强阳性、弱强阳及阴性表达所占比例：①Bcl2在异常软骨终板、异常纤维环、异常髓核中阳性表达所占比例数低于阴性表达所占比例数，且Bcl2在异常软骨终板中阳性表达所占比例数低于在异常纤维环和异常髓核中阳性表达所占比例数；②Fas在异常软骨终板、异常纤维环、异常髓核中阳性表达所占比例数高于阴性表达所占比例数，且Fas在异常软骨终板中强阳性表达所占比例数高于在异常纤维环和异常髓核中强阳性表达所占比例数；③Sox9在异常软骨终板、异常纤维环、异常髓核中阳性表达所占比例数低于阴性表达所占比例数，且Sox9在异常软骨终板中阳性表达所占比例数低于在异常纤维环和异常髓核中阳性表达所占比例数2、数据结果上一步所摄得图片进行免疫反应产物显微图像分析，得出平均光密度值和积分平均光密度值，用SPSS统计软件进行数据处理，计算各指标的均数和标准差，用单方差分析法分析总体差异及各组间及各组内差异：①Bcl2的表达在正常颈椎间盘的软骨终板、纤维环、髓核中均高于突出颈椎间盘的各相应组(p＜0.01)；②Fas的表达在正常颈椎间盘的软骨终板、纤维环、髓核中均低于突出颈椎间盘的各相应组；(p＜0.01)；③Sox9的表达在正常颈椎间盘的软骨终板、纤维环、髓核中均高于突出颈椎间盘的各相应组(p＜0.01)；④在异常颈椎间盘的软骨终板中Bcl2的表达低于其在纤维环和髓核中的表达(p＜0.01)，Bcl2的表达在纤维环和髓核中无统计学差异(p＞0.05)；在正常颈椎间盘的软骨终板中Bcl2的表达高于其在纤维环和髓核中的表达(p＜0.01)，Bcl2的表达在纤维环和髓核中无统计学差异(p＞0.05)；⑤在异常颈椎间盘的软骨终板中Fas的表达高于其在纤维环和髓核中的表达(p＜0.01)，Fas的表达在纤维环和髓核中无统计学差异(p＞0.05)；在正常颈椎间盘的软骨终板中Fas的表达低于其在纤维环和髓核中的表达(p＜0.01)，Fas的表达在纤维环和髓核中无统计学差异(p＞0.05)；⑥在异常颈椎间盘的软骨终板中Sox9的表达低于其在纤维环和髓核中的表达(p＜0.01)，Sox9的表达在纤维环和髓核中无统计学差异(p＞0.05)；在正常颈椎间盘的软骨终板中Sox9的表达高于其在纤维环和髓核中的表达(p＜0.01)，Sox9的表达在纤维环和髓核中无统计学差异(p＞0.05)；结论1、Bcl2、Fas和Sox9基因参与了细胞凋亡所导致的椎间盘退变过程，Bcl2随着退变发生表达降低，使抑制椎间盘细胞凋亡的作用减弱；Fas随着退变发生表达增加，起促进椎间盘细胞凋亡作用；Sox9随着退变发生表达降低，致使Col2al表达降低，椎间盘Ⅱ型胶原产生减少，使抑制椎间盘细胞凋亡的作用减弱。2、本试验分别研究了软骨终板、纤维环及髓核中的细胞凋亡，在退变椎间盘的软骨终板内Bcl2最低，Fas最高，Sox9最低，提示椎间盘细胞凋亡始于软骨终板，软骨终板钙化是导致椎间盘退变的始动因素。