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目的:研究皮肤切创愈合过程中FOXO1的表达与分布特征,探讨FOXO1在正常伤口及糖尿病伤口形成时间推断中的应用价值。 方法:取45只成年雄性小鼠C57BL/KsJ(由南京大学模式动物研究所提供),体重25~30g,随机分为9组,每组5只,用作对照组伤口小鼠,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,于背部皮肤剪毛处理,在其背部中央区域做一长1cm的皮肤全层纵行切口,作为对照组小鼠皮肤切创模型,分别装入笼中进行饲养。然后分别于切创后的0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d,用乙醚将9组小鼠麻醉后,使用脱颈椎的方法将其处死,并以切创的创口为中心,取伤口及周边区域处1.5cm×2cm大小的皮肤。再取成年C57BL/KsJ(db/db)小鼠45只,作为糖尿病组伤口小鼠,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,于背部皮肤剪毛处理,在其背部中央区域做一长1cm的皮肤全层纵行切口,作为糖尿病组小鼠皮肤切创模型,分别装入笼中进行饲养。然后分别于切创后的0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d,用乙醚将9组小鼠麻醉后,使用脱颈椎的方法将其处死,并以切创的创口为中心,取伤口及周边区域处1.5cm×2cm大小的皮肤。每个时间点的两组5只小鼠的皮肤样本都分为两部分,部分用于HE染色和免疫组织化学染色,另一部分用于Westernblot检测。通过HE染色观察伤口愈合的形态学变化;通过免疫组织化学染色检测FOXO1的表达与分布特征,分析伤口中性粒细胞、单核细胞及成纤维细胞的细胞总数及FOXO1阳性染色细胞数,计算FOXO1表达的阳性细胞率;通过Western印迹法检测伤口FOXO1蛋白表达的相对水平。采用SPSS19.0forWindows软件对结果进行统计学分析,明确FOXO1表达的时序性变化,探讨FOXO1在正常伤口及糖尿病伤口形成时间推断中的应用价值。 结果: (1)糖尿病组显示了延迟的伤口收缩和愈合。和对照组相比,糖尿病组中性粒细胞和单核细胞浸润延迟,中性粒细胞于伤后1-3d显著增多,单核细胞于伤后5d显著增多,伤后7-10d的伤口仍可见较多中性粒细胞和单核细胞浸润。此外,和对照组相比,糖尿病组伤后3-14d的伤口成纤维细胞密度较低,伤后14d形成的瘢痕组织较疏松。 (2)在对照组小鼠,FOXO1在表皮、毛囊、皮脂腺、血管内皮及真皮中少数的成纤维细胞呈现出弱表达;伤后6-12h创口周边区表皮及皮肤附件FOXO1表达增强,可见浸润的中性粒细胞和少量单核细胞表达FOXO1;伤后1-3dFOXO1以单核细胞阳性表达为主;伤后5-10dFOXO1以新生血管内皮细胞及成纤维细胞表达为主;伤后14d仍有少量成纤维细胞表达FOXO1;其中伤后7d的FOXO1阳性细胞率达到高峰。FOXO1在对照组蛋白表达的相对水平呈现一定的时序性变化,其中伤后12h和伤后7d为FOXO1的两个表达峰值; (3)在糖尿病组小鼠可见FOXO1表达于毛囊、表皮、血管内皮细胞;伤后6-12h创口区可见浸润的中性粒细胞表达FOXO1;伤后1-5dFOXO1以单核细胞阳性表达为主;伤后7dFOXO1以成纤维细胞阳性表达为主;伤后7-14dFOXO1的阳性表达率显著下降;其中伤后1d的阳性细胞率达到高峰。FOXO1在糖尿病组小鼠蛋白表达的相对水平亦呈现一定的时序性变化,其中伤后6h和伤后1d为FOXO1的两个表达峰值。 (4)与对照组伤后各时间点相比,糖尿病组在伤后6h、伤后1d及伤后3d的FOXO1蛋白表达相对水平显著升高。 结论: (1)糖尿病伤口愈合能力受损,伤口炎细胞浸润延迟但不易消退,修复形成的瘢痕组织较疏松。 (2)FOXO1在正常伤口及糖尿病伤口中的不同类型细胞呈现广泛表达,提示其密切参与了皮肤损伤愈合的进程。 (3)FOXO1的表达在正常伤口及糖尿病伤口中呈现时序性变化,可为伤口形成时间的推断提供参考依据。 (4)FOXO1在糖尿病伤口形成后6h、1d及3d的蛋白表达相对水平显著升高,提示其可作为鉴别糖尿病早期伤口的重要参考指标。