一、背景随着社会的发展和生活水平的提高,感染性疾病所导致的死亡不断减少,而动脉粥样硬化疾病导致的死亡迅速增多,目前已成为全球人口死亡的首位原因。高热量、高饱和脂肪酸食物摄入过多以及缺乏体力活动等不良生活方式是其元凶。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是缺血性心脏病、脑血管病等心脑血管疾病的病理基础。抗动脉粥样硬化药的应用,对防治心脑血管疾病具有重要的战略意义。虽然人类认识动脉粥样硬化是一种疾病并对其发病机制进行相关研究也有100余年的历史,而AS的发病机制至今尚未明确。随着动脉粥样硬化研究的不断深入,AS中新的细胞因子不断检出。使炎症已成为AS发生发过程中的重要因素.特别是炎症标志物,高敏C-反应蛋白（hs-CRP）,白细胞介素-1（IL-8）,可溶性粘附因子（sICAM-1）,P-选择素（P-selsctin）、可溶性血管细胞粘附因子（sVCAM-1）,整合素CDll/CD18等均在动脉粥样硬化中有表达并发挥作用。使炎症机制越来越被重视。但是其中炎性因子影响动脉粥样硬化形成的机制尚不清楚,时间顺序、细胞来源、胞靶位、诱导抗原对动脉粥样硬化的许多因子来说仍是个谜。核因子NF-κB是一种广泛存在于细胞中的多显性转录因子,具有多向转录调节作用,它与多种基因的转录有关糸,尤其是与免疫炎症相关基因,如各种粘附分子、细胞因子、生长因子和免疫受体等的转录调控密切相关。以前的研究证实,NF-κB仍可能是启动动脉粥样硬化的关键因子。由血管壁LDL的修饰到引发炎症,趋化因子的释放,内皮细胞表面黏附分子的表达,这些程序导致单核细胞向待损害部位聚集,均有NF-κB参与。第一,在早期LDL修饰和炎性脂质介质形成过程中有几种很重要的酶。包括:磷酸激酶A2、5-脂氧化激酶、12-脂氧化激酶、环氧化酶2（COX2）,都受N F-κB调控。第二,单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是使单核细胞在早期损害发展中聚积的关键因子,受NF-κB调控。第三,NF-κB在炎症应答时调控多种黏附分子的表达。这些炎性刺激物包括P-selsetin、E-selsetin、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）,都参与了鼠模型动脉粥样硬化的发展过程。但是其中那些细胞因子又是如何表达调控的,具体机制如何,是否还存在其他的转导通路尚待研究。明确AS中炎症因子的表达谱,从而探讨AS中的炎症机制,对于探及研究有效的防治药物意义重大。从中医临床来说,虽然没有动脉粥样硬化的概念,但根据病因,临床表现,并发症等特征,散见于中医“胸痹”“中风”,“眩晕”,“头痛”,“痰证”,“瘀证”等的记载中,但不单指一种病。总病机可概括为为本虚标实之证,本虚为脾虚,心脾虛,肾虚,标实为气滞,血瘀,痰浊。治疗多以活血化瘀、消食化痰、利水滲湿、补虚扶正为大法。中医药对于抗动脉粥样硬化机制的研究具有多层次,多角度,多靶点的特征,主要从调节血脂紊乱、保护血管内皮、抑制血栓形成和抑制血管平滑肌增殖、抗炎、抗氧化、改善血流变等途径。补阳还五汤是晚清名医王清任所创,主治中风后遗症中属正气亏虚而致血脉不利者。现代研究证明,补阳还五汤有改善血液流变学,降血脂,抗血栓,改善心肌缺血,抗动脉粥样硬化,对周围神经损伤的修复等作用。而其对于气虚血瘀心脑血管病已获得医学界的重视。但抗动脉粥样硬化药理机制研究尚缺乏系统的认识。二、目的本研究拟采用载脂蛋白E（apolipoprotein E,ApoE）基因敲除小鼠(ApoE^-/-)复制模型,研究中药复方补阳还五汤对动脉粥样硬化的防治作用,同时利用蛋白液相芯片系统研究动脉粥样硬化炎症反应以及补阳还五汤干预后炎症细胞因子的表达谱变化,并采用蛋白迁移率实验及蛋白凝胶实验等分子生物技术初步验证细胞因子的信号转导通路,阐述动脉粥样硬化的炎症形成机制和补阳还五汤的作用机理,为临床治疗动脉粥硬化引起的心脑血管病提供理论基础。三、方法24只雄性Apo E^-/-小鼠随机分为3组,每组8只,分别为模型组(Apo E^-/-+高脂),补阳还五汤组(Apo E^-/-+高脂+补阳还五汤),舒降之组(Apo E^-/-+高脂+舒降之),并以8只雄性C₅₇BL/6J(Apo E^-/小鼠来源于C₅₇BL/6J)作为空白对照组。所有动物适应性喂养5天后,模型组,舒降之组,补阳还五汤组高脂饲料喂养造模.补阳还五汤组灌服补阳还五汤口服液,每日一次;舒降之组给予辛伐他汀灌胃,每日一次,其他组灌服等剂量生理盐水。连续灌胃14周。造模造模后,眼球取血,分离血清,酶法检测血脂四项。取出心脏和主动脉,并将其再分成两部分,一部分沿心房尖间划线形成的平面切除下面部分,再放入10%中性福尔马林溶液中固定,一部分放入-80℃冰箱中保存。福尔马林溶液固定后的心肌组织常规石蜡包埋、切片。从心脏向血管的方向连续切片。从主动脉辦出现到消失,即主动脉窦区域。HE染色或油红O染色观察各组的病理变化。使用LiquiChip蛋白液相芯片系统检测组织细胞因子,LINCO公司的试剂盒可以同时检测mIL-1α、mIL-1β、mIL-4、mIL-5、mIL-6、mlL-7、mIL-9、mIL-10、mIL-12p70、mlL-13、mIL-15、mIL-17、mIFN-γ、mTNF-α、mGM-CSF、mMIP-1a、mMCP-1、mKC、mRANTES、mIP-10,mG-CSF。部分心肌组织用Western及IP细胞裂解液提取心肌组织蛋白,Bradford法进行蛋白定量,进行蛋白印迹实验。以β-actin为内参,将处理好的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离,电泳结束后将蛋白质转移到PVDF膜上,封闭后,孵育一抗和二抗,ECL显色,Kodak Image Station 2000MM成像系统采集图像,获得图像用图像处理软件Image Tool 3.0测定并分析条带平均积光密度值以检测p38、ERK和JNK及其磷酸化蛋白P-p38、P-ERK和P-JNK的表达水平。部分心肌用核蛋白浆蛋白提取试剂盒提取核蛋白,Bradford法进行蛋白定量,进行凝胶蛋白迁移率试验（EMSA）。处理好样品SDS-PAGE分离,加样前预电泳,加样电泳直至酚蓝达到凝胶顶部3/4处停止,然后转至硝酸纤维膜上,加入ECL试剂柯达2000MM图像工作站成像。四、结果1、补阳还五汤对动脉粥样硬化模型病理变化的影响,饲喂高脂饲料饮食,14周后处死动物,取心脏和主动脉,在主动脉根部的相对应区域进行切片,保证样本之间的可比性。结果发现模型组斑块形成明显,动脉腔显著变小,补阳还五汤显著降低AS斑块形成,与模型组有差异显著。2、补阳还五汤对apoE^-/-小鼠血脂的影响检测血脂四项,结果发现补阳还五汤对血脂的影响与对照组相比减少无显著意义（P＞0.05）,舒降之与其他组比较,减少有显著性意义（P＜0.001）。说明舒降之能显著的降低甘油三酯（TG）和胆固醇（CHOL）、升高HDL的作用。这与在大鼠和小鼠上的报道并不一致,可能与apoE基因缺失有关。3、LiquiChip蛋白液相芯片系统检测组织细胞因子显示:与空白组比较,模型组GM-CSF、IL-1、IL-6、IL-6和TNFα均增加有显著性意义（P＜0.001）。而与模型组比较,补阳还五汤组TNFα表达减少有显著性意义（P＜0.001）;舒降之组与模型组比较IL-1β和IL-6表达减少有显著性意义（P＜0.001）;二者与模型组比较GM-CSF减少和IL-10表达增加有显著性意义（P＜0.001）。4、补阳还五汤对MAPK家族成员p38、ERK和JNK及其磷酸化蛋白P-p38、P-ERK和P-JNK的表达的影响。通过分析结果中目的条带图像发现,补阳还五汤对p38及其磷酸化蛋白的表达影响与其他组比较减少无显著性意义（P＞0.05）;模型组ERK和JNK,P-ERK和P-JNK表达相对与其他组均增加有显著性意义（P＜0.001）。与模型组相比,补阳还五汤减少有显著性意义（P＜0.001）。说明补阳还五汤能降低此二者及其磷酸化水平的表达,可能是其调节细胞因子表达的机制之一。5、补阳还五汤对NF-κB活化的影响。应用Pierce的Lightshiftchemiluminescent EMSA Kit,通过分析结果中目的条带图像发现,高脂饲料能够引起动脉粥样硬化模型小鼠NF-κB的活化,模型组与空白对照组相比,增加有显著性意义（P＜0.001）。而与模型组比较,补阳还五汤及舒降之组均减少具有显著性差异（P＜0.001）。可能为抑制NF-κB活化降低了某些细胞因子的转录,可能是补阳还五汤抑制AS炎症的重要机制。五、结论1、补阳还五汤可明显减轻动脉粥样硬化的损伤程度,对动脉粥样硬化的组织结构具有明显的保护作用。2、补阳还五汤和舒降之均能通过降血脂的作用而减轻动脉粥样硬化的危险因素。3、动脉粥样硬化时,炎症细胞因子的表达谱发生明显改变,补阳还五汤能明显影响部分炎症细胞因子的表达。4、通过蛋白水平的验证,补阳还五汤明显降低ERK和JNK以及两者磷酸化水平的表达,可能是其调节细胞因子表达的机理之一。5、2poE^-/-小鼠的动脉粥样硬化模型中NF-κB被活化,而补阳还五汤能够抑制NF-κB的活化,NF-κB活化的抑制可能降低了某些细胞因子的转录,可能是补阳还五汤抑制AS炎症的重要机制。