随着工业的发展,大气颗粒物污染越来越严重,给人类健康造成极大危害。PM2.5是指空气动力学直径≦2.5微米的大气悬浮颗粒物,主要来自煤炭燃烧、机动车尾气及工业废气的排放等过程,是形成雾霾天气的主要原因。目前认为PM2.5毒性机理主要包括以下可能机制,PM2.5首先与肺上皮细胞作用,刺激后释放各种细胞因子,PM2.5还能进一步与细胞作用,释放活性氧自由基等,氧化损伤组织细胞。气道炎症发生的早期是以支气管上皮细胞的炎症反应开始的,炎症因子的改变则是PM2.5致炎症作用的主要原因之一。为推动我国大气污染与人体健康关系的研究,开展PM2.5的毒性机制研究是必要且迫切。本研究以Beas-2B细胞为研究对象,考察PM2.5对人支气管上皮细胞的毒性作用与机制,采用MTT比色法检测不同浓度下PM2.5对细胞生长的抑制情况;在显微镜下观察PM2.5对细胞形态的影响;通过NO、ROS荧光探针实验检测PM2.5毒染细胞后细胞内NO和ROS氧化应激水平的变化;通过Hoechst33258实验和流式细胞术检测不同浓度的PM2.5对细胞凋亡的诱导情况影响。为进一步研究PM2.5及其主要多环芳烃类成分荧蒽、芘及菲对人支气管上皮细胞的损伤作用和机制,选用PM2.5主要成分荧蒽、芘及菲为研究对象,采用MTT比色法检测不同浓度下荧蒽、芘、菲对细胞生长的抑制情况;利用Real-Time PCR检测其毒染细胞后细胞内炎症因子和白细胞介素相关细胞因子的mRNA转录水平表达的影响;应用Western blot方法检测其处理细胞后炎症因子相关信号通路NF-κB、p38MAPK及和Nrf2表达和信号通路激活作用,同时检测相关凋亡蛋白p53、Bcl2、Bax和caspase1、3、12的表达情况。最后,为阐明PM2.5的主要多环芳烃类成分荧蒽和芘在体内运输机制,以BSA为蛋白模型,采用紫外光谱法研究荧蒽,芘与BSA作用后BSA蛋白质中芳香族残基微环境的变化以及BSA分子的二级结构变化;采用荧光光谱法研究荧蒽、芘与BSA的相互作用及分子构象,通过公式计算荧蒽,芘与BSA距离,判断是否镶嵌到BSA分子内部;采用同步荧光光谱法测量最大发射波长的改变,研究检测荧蒽、及芘与BSA的相互作用后氨基酸残基的环境的相应变化;采用三维荧光光谱法描述酪氨酸和色氨酸残基的结构变化和多肽链结构的变化,判断荧蒽、芘在BSA分子内部的结合位点。结果表明,PM2.5可以显著抑制细胞增殖能力并存在剂量依赖性关系。镜下观察通过不同剂量PM2.5处理后的细胞形态从梭形变成圆形,细胞出现皱缩且细胞数目随浓度增加明显减少。并且随着PM2.5浓度的增加,细胞内NO和ROS荧光强度明显增加,表明PM2.5使氧化应激程度增加。Hoechst33258和流式细胞术实验结果表明,PM2.5可以有效的诱导Beas-2B细胞的凋亡,并存在一定的浓度依赖。Real Time PCR检测结果表明,PM2.5、荧蒽、芘及菲处理后细胞内炎症相关因子及白细胞介素表达均上调,表明PM2.5、荧蒽、芘及菲均能诱导炎症反应。Western blot检测结果表明,PM2.5可以激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信号通路。研究还发现,荧蒽、芘、菲均的结果具有和PM2.5相同趋势仅部分凋亡相关蛋白未检测能够诱导炎症相关因子的表达,激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信号通路。光谱研究表明,加入荧蒽和芘后分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的疏水基团裸露同时BSA肽链伸展,紫外光谱表现为明显的增色效应以及改变了BSA分子的二级结构;荧光猝灭机制的探讨中通过Stern-Volmer方程计算出荧蒽和芘对BSA的结合特性均为静态猝灭,并且随着温度升高结合点和平衡常数均有下降也符合静态猝灭机制,再根据Forster的非辐射能量转移理论,计算出荧蒽和芘与BSA相互作用后与色氨酸之间结合距离r和能量转移效率E,二者与BSA色氨酸之间的结合距离r,表明它们之间发生能量转移的可能性很高。通过热力学公式计算在不同温度条件下,FLA-BSA和PYR-BSA的ΔG、ΔH、ΔS,并判断出表明相互作用力均是疏水作用。再通过同步荧光光谱法判断FLA和PYR对BSA中发光荧光团酪氨酸残基微区和色氨酸残基微区的影响。最后使用三维荧光光谱法确定结合位点是在BSA疏水腔,导致了疏水性微环境极性改变,最终引起BSA构象变化。综上所述,PM2.5及其主要的多环芳烃成分还可以导致细胞的毒性作用,并且能引发致炎症作用,激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信号通路,PM2.5的部分成分在体内运输机制是通过与BSA结合实现。本研究为我国大气污染与人体健康关系的研究提供了一定的毒性致炎机制的理论基础和实验依据。