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猪瘟病毒(CSFV)可在多种动物的组织细胞中复制,但一般不产生致细胞病变效应(CPE)。CSFV感染猪后可使小血管和毛细血管内皮细胞发生变性和坏死,为了方便研究猪瘟病毒的致病机理并提供理想的细胞模型,我们开展了猪脐静脉血管内皮细胞体外培养方法的研究,但细胞通常在体外培养条件下经过10次内的传代后,就会停止分裂增殖,发生衰老和死亡。有学者在体外培养原代细胞的基础上,诱导其自发性永生化或转染永生化基因(如SV40大T抗原和HPV18 E6/E7等DNA肿瘤病毒),建立了永生化细胞系。但肿瘤病毒诱导的永生化细胞系,有许多局限性:外源性基因的整合是随机的,其表达产物可干扰细胞内生理途径而发生非预期的改变,转染获得的是转化细胞而非正常细胞,其表型、核型等可发生改变等。为了克服这种细胞系的缺点,本研究将人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因转染至猪脐静脉血管内皮细胞,激活端粒酶,以期建立永生化血管内皮细胞系。研究获得了以下结果:1.无菌采取猪脐带,用0.1%胶原酶消化分离内皮细胞,于37℃、5%CO2条件下培养。采用脂质体转染法,将编码hTERT的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入原代培养的猪脐静脉细胞。隔天后加G418筛选,约1个月后,抗性细胞克隆形成,滤纸片法转移、扩增,hTERT稳定转染入细胞,同时细胞端粒酶活性转为阳性。细胞在体外长期连续培养下生长良好,已传至15代。2.对转染后细胞进行蛋白表达及增殖等生物学的观察。结果表明,70%细胞在24h内贴壁,3～4d长成单层,典型铺路石状。转染后内皮细胞F-ⅧAg和CD34免疫荧光染色鉴定为阳性,第15代内皮细胞端粒酶活性检测为阳性。细胞计数绘制细胞生长曲线,表明培养过程中细胞生长具有典型的S特征。证明转染后的猪脐静脉血管内皮细胞保留了原代内皮细胞的生物学特征。以上结果表明,本试验成功的将脂质体介导的hTERT转染入猪脐静脉血管内皮细胞,hTERT转染可以延长猪血管内皮细胞的寿命,由于时间的限制,现传至15代,为猪脐静脉血管内皮细胞的永生化奠定了基础。