原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC,以下简称肝癌）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝癌在我国的发病率仅次于肺癌，且发病率逐年上升，目前已成为我国重要的恶性肿瘤致死原因之一。在我国，乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）所引发的肝脏慢性炎症是导致肝癌发生、发展最重要的因素。目前，肝癌的治疗仍以手术治疗为主的综合治疗，5年生存率仍较低。限制肝癌手术治疗效果的主要瓶颈是早期诊断率低和术后复发率高，而手术以外仍缺少效果确切的辅助治疗，故深入研究肝癌发生和发展中的分子机制、开发新的诊断标志物和治疗靶点成为当前肿瘤研究的热点和重点领域。长链非编码RNA（long noncoding RNAs lncRNA）是由基因组中非编码序列转录生成的、长度大于200nt、不具有翻译成蛋白质能力的转录本。在很长一段时间内非编码基因被认为是基因组中的“噪音”和“暗物质”。近年来，大量实验证明由部分基因组中的“暗物质”所转录的长链非编码RNA在表观遗传水平、转录水平、翻译水平、蛋白修饰过程中均可发挥重要的调控作用。但是相比于编码蛋白基因，目前对肝癌发生发展过程中长链非编码RNA的作用仍知之甚少，缺乏系统的研究。因此，本研究通过高通量的手段检测正常肝脏组织、慢性肝炎组织、肝硬化组织和肝癌组织中长链非编码RNA的表达，筛选在原发性肝癌发生和发展中可能发挥重要作用的长链非编码RNAs（包括MVIH和DANCR）进行深入研究，以期系统、深入地揭示长链非编码RNA在肝癌发生发展中所扮演的角色，为肝癌的诊断和治疗提供新的分子靶标。第一部分正常、肝炎、肝硬化和肝癌肝脏组织中长链非编码RNA的芯片检测和分析研究目的：系统地考察病变肝脏组织中长链非编码RNAs的差异表达并筛选关键长链非编码RNAs作为深入研究的候选分子。研究方法：挑选行肝脏切除术后的正常、慢性肝炎、肝硬化、肝癌癌和癌旁等肝脏组织，使用芯片系统地检测长链非编码RNA和信使RNA的表达，利用生物信息学筛选与肝癌发生发展相关的长链非编码RNAs。结果：长链非编码RNA和信使RNA在肝癌病人的肿瘤组织与癌旁组织、不同转移潜能的肿瘤组织中显著差异表达,其中长链非编码RNA-MVIH在肿瘤组织中显著上调表达；肝硬化和肝癌中长链非编码RNA和信使RNA的表达显著差异于正常肝脏组织和慢性肝炎组织；一组由长链非编码RNA和信使RNA构成的基因标签能够反映炎癌转化过程的不同阶段，其中长链非编码RNA-DANCR可能在肿瘤发生过程中发挥关键作用；此外，我们发现联合长链非编码RNA和信使RNA可以更好地区分不同转移潜能的肝癌组织。结论：长链非编码RNAs在肝癌发生、发展中差异表达，并有潜在的调控作用和临床意义；候选长链非编码RNA-MVIH和-DANCR可能在肝癌中发挥关键作用。第二部分长链非编码RNA-MVIH诱导新生肿瘤血管生成从而促进肝癌转移研究目的：本部分研究旨在探讨长链非编码RNA-MVIH在肝癌肿瘤新生血管形成中的功能与临床意义。研究方法：在大规模临床样本中观察MVIH表达与临床病理因素及预后的相关性，体外和体内试验研究MVIH对肿瘤生物学特性的影响，免疫共沉淀的方法寻找与MVIH相互结合的分子并深入研究MVIH的作用机制。结果：MVIH在原发性肝癌组织中上调表达并与肿瘤微血管侵犯（MVIH， Micro-Vascular Invasion in HCC，P=0.016）和肿瘤临床TNM分期（P=0.009）显著相关；MVIH高表达的病人术后的无瘤生存（RFS, P0.001）和总体生存（OS, P=0.007）都要低于MVIH低表达的病人，多因素分析显示MVIH高表达是影响肝癌病人肝脏切除术后预后的独立危险因素；对于巴塞罗那（BCLC）分期早期的肝癌病人中，MVIH高表达也能预示着较差的无瘤生存（P=0.003）；过表达MVIH促进肿瘤细胞在小鼠体内的生长和转移能力；MVIH能结合PGK1蛋白并抑制PGK1蛋白的分泌，解除PGK1蛋白对肿瘤新生血管的抑制作用从而促进肿瘤新生血管的形成。结论：长链非编码RNA-MVIH能预测肝癌病人切除术后的预后，尤其对于BCLC早期的病人，具有潜在的临床应用价值；此外，MVIH能通过结合并抑制PGK1蛋白的分泌促进肿瘤新生血管的形成，从而促进肿瘤的生长和转移，为肝癌的抗血管治疗提供了新的思路。第三部分长链非编码RNA-DANCR在肝癌起始细胞扩增中的作用及分子机制研究目的：探究长链非编码RNA-DANCR在肝癌进展过程中的作用和分子机制。研究方法：利用染色质免疫共沉淀实验、炎症通路激活剂应用等考察NF-kB和p-STAT3对DANCR的转录调控；慢病毒载体过表达或者干扰实现关键lncRNA的功能再现或者阻断，观察其对肝细胞或者肝癌细胞生物特征的影响；RNA纯化实验寻找与DANCR相互结合的RNA；利用RNA小干扰序列体内干扰DANCR观察DANCR作为治疗靶点的效率以及在临床样本考察DANCR作为分子标志物的意义。结果：长链非编码RNA-DANCR可被炎症通路重要转录因子NF-kB和STAT3调控，在来自于多中心的肝癌样本中均显著上调表达，对公共数据库的分析DANCR在人和鼠的胎肝中均维持高表达，证明DANCR为癌胚长链非编码RNA；DANCR在干性特征明显的细胞中高表达，过表达DANCR能上调肿瘤起始细胞相关基因的表达水平并能扩增CD90、EpCAM阳性肿瘤细胞的数量；而抑制DANCR能下调肿瘤起始细胞相关基因的表达水平，降低CD90、EpCAM阳性肿瘤细胞的数量，并能一定程度上改善肿瘤细胞的化疗抵抗；DANCR能在体外和体内促进肿瘤的形成，具有显著的促癌效应；在临床样本中，我们发现在癌前病变组织中DANCR的表达量就已经出现显著地上调，并且同源基因Dancr在DEN诱癌小鼠模型中表现为逐渐上调，进一步说明了DANCR在肿瘤形成过程中的作用；在大规模、多中心肝癌样本中，DANCR的高表达预示着肝癌病人术后较差的无瘤生存和总体生存；在小鼠体内干扰DANCR可以有效地减缓肿瘤的生长并且可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有潜在的临床应用价值；DANCR可以结合CTNNB1mRNA的3’-UTR区域并阻断miRNA-215、miRNA-199a和miRNA-320a等与CTNNB1mRNA的结合从而解除miRNAs对CTNNB1的负调控，而DANCR对肿瘤起始细胞的调控依赖细胞浆中的“CTNNB1库”的增加。结论：受炎症激活的长链非编码RNA-DANCR在肿瘤起始细胞扩增和肿瘤发生过程中发挥中重要作用，可作为肝癌预后预测标志物和药物设计的靶点。