前言：　　 肾癌中绝大多数为肾透明细胞癌,根治性手术切除是肾癌最有效的治疗方法,晚期肾癌的治疗一般不推荐手术切除,而且肾癌对放疗和化疗均不敏感,因此近年基因治疗成了研究的新方向,如果能找到新的癌基因和抑癌基因,并作为新的治疗靶点应用于临床,将有望对肾癌的诊断及治疗提供帮助。CDC25B是CDC25家族中重要的成员之一,是细胞有丝分裂的激活剂,可以加速细胞分裂。目前认为,CDC25B所编码基因是一种新的癌基因,过量的CDC25B可促进肿瘤的生长和细胞的恶性转化。由于CDC25B在细胞有丝分裂中的重要作用,且与多种肿瘤有着密切关系,所以成为目前研究的热点。现已经证明CDC25B在人类多种肿瘤中都有过度表达,其中包括:前列腺癌、食管鳞癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、头颈部癌、胃癌、非小细胞肺癌、甲状腺肿瘤、神经母细胞瘤和子宫内膜癌。在肾癌中尚未有相关检测。14-3-3蛋白家族是真核生物细胞中一类含量丰富的高度保守的蛋白质,目前14-3-3蛋白与癌症相关的主要证据来源于14-3-3σ,14-3-3σ的表达水平在各种各样的转染细胞系以及乳腺癌、胃癌、肝癌中都有显著下降,这种表达水平的下降主要由于14-3-3σ的启动子被甲基化。研究表明,CDC25B蛋白丝氨酸磷酸化后,可以成为14-3-3σ的一个蛋白结合点,14-3-3σ蛋白通过与CDC25B结合,调控CDC25B的核浆穿梭运转,因此14-3-3σ可能与CDC25B的NLS和NES协同,来调控CDC25B的态核浆穿梭转运及其亚细胞定位,从而影响细胞周期进程。研究表明,CDC25B是14-3-3σ蛋白的可能的作用底物。　　 目的：　　 本项目通过肾透明细胞癌组织和细胞中CDC25B和14-3-3σ蛋白作用及相互作用的研究,揭示这两个蛋白在肾透明细胞癌细胞增殖、凋亡和侵袭力过程中发挥的重要作用,进一步来指导临床上肾癌的诊断与治疗。　　 实验方法：　　 1、检测不同临床病理分期的肾癌组织中CDC25B和14-3-3σ蛋白表达和活性。　　 从临床病例中选取术后病理回报为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肾癌组织各30例通过免疫组化、WesternBlot和RT-PCR分别检测CDC25B和14-3-3σ蛋白表达。使用癌旁组织作为对照组。　　 2、分别检测CDC25B和14-3-3σ蛋白在肾癌769-P和ACHN细胞中的表达。　　 (1)WesternBlot和RT-PCR检测CDC25B蛋白在肾癌769-P和ACHN细胞中的表达。　　 (2)WesternBlot和RT-PCR检测14-3-3σ蛋白在肾癌769-P和ACHN细胞中的表达。　　 3、挑选表达量大的细胞系分别转染CDC25BshRNA和14-3-3σshRNA。　　 769-P和ACHN细胞置于含10%胎牛血清的1640培养基中,37.5%NCO2,孵箱内培养至对数生长期。用0.25%胰酶消化并调节细胞浓度以每孔106个细胞接种于6孔板中。实验分为CDC25BshRNA、14-3-3σshRNA、controlshRNA组并设置正常空白对照组,shRNA浓度均为20pmol。转染769-P和ACHN细胞方法和步骤参照脂质体说明书进行。转染48h后进行后续操作。　　 4、检测转染后的肾癌细胞增殖、凋亡和侵袭力的改变。　　 (1)MTT法检测细胞增殖能力;　　 (2)AnnexinV-FITC/PI-FCM实验来检测肾癌细胞的凋亡;　　 (3)Transwell检测肾癌细胞侵袭力。　　 5、WesternBlot和RT-PCR检测转染14-3-3σshRNA的肾癌细胞中CDC25B的表达,及转染CDC25BshRNA的肾癌细胞中14-3-3σ的表达。　　 实验结果：　　 1、CDC25B蛋白在各组中的表达及其与肾透明细胞癌的关系　　 (1)所有组织中均有CDC25B蛋白的表达,肾透明细胞癌组织中呈高水平表达,并且肾癌各病理分级间的表达亦有差异,从Ⅰ级到Ⅲ级随着肿瘤的分化程度降低而表达呈逐渐增加的趋势。　　 (2)CDC25B蛋白在肾透明细胞癌组织中各临床分期中的表达也有显著差异,有统计学意义(P＜0.05)。　　 2、14-3-3σ蛋白在各组中的表达及其与肾透明细胞癌的关系　　 (1)所有组织中均有14-3-3σ蛋白的表达,肾透明细胞癌组织中呈低水平表达,并且肾癌各病理分级间的表达亦有差异,从Ⅰ级到Ⅲ级随着肿瘤的分化程度降低而表达呈逐渐减少的趋势。14-3-3σ在Ⅰ级肾癌组织与癌旁正常肾组织相比无显著差异,无统计学意义。　　 (2)14-3-3σ蛋白在肾透明细胞癌组织中T1和T2期无明显差异,T1,T2和T3相比有显著差异,有统计学意义(P＜0.05)。　　 3、CDC25B和14-3-3σ在肾癌769-P和ACHN细胞中均表达,ACHN的恶性度高于769-P,CDC25B在ACHN中表达高于769-P,14-3-3σ在769-P中表达高于ACHN。　　 4、14-3-3σshRNA转染769-P后检测肾癌细胞增殖、凋亡和侵袭力的改变。　　 (1)14-3-3σ蛋白被干扰后,24h、48h、72h后,随着时间的延长,肾癌769-P细胞的增殖能力显著提高,各时间组与浓度组之问差异具有统计学意义。　　 (2)14-3-3σ蛋白被干扰后,肾癌769-P细胞的凋亡减低。　　 (3)14-3-3σ蛋白被干扰后,肾癌769-P的体外运动增强。小室侵袭实验表明,干扰组的细胞数高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05),结果表明,干扰后促进了肿瘤细胞的侵袭能力,与对照组相比,干扰组细胞数上升了31.4%。　　 5、CDC25BshRNA转染ACHN后检测肾癌细胞增殖、凋亡和侵袭力的改变。　　 (1)CDC25B蛋白被干扰后,24h、48h、72h后,随着时间的延长,肾癌ACHN细胞的增殖能力显著降低,各时间组与浓度组之间差异具有统计学意义。　　 (2)CDC25B蛋白被干扰后,肾癌ACHN细胞的凋亡增加。　　 (3)CDC25B蛋白被干扰后,肾癌ACHN的体外运动减弱。小室侵袭实验表明,干扰组的细胞数低于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05),结果表明,干扰后降低了肿瘤细胞的侵袭能力。　　 6、转染后检测14-3-3σ表达无明显变化,CDC25B表达增强。　　 结论：　　 1、CDC25B在肾癌中的表现为原癌基因的作用,而14-3-3σ可能在肾癌中的作用为抑癌作用。　　 2、CDC25B与肾癌的恶性程度呈正相关,14-3-3σ与肾癌的恶性程度呈负相关。CDC25B和14-3-3σ可能成为肾癌潜在的诊断标记和新的判定肿瘤恶性度的指标。　　 3、研究表明CDC25B是14-3-3σ蛋白的可能的作用底物,CDC25B和14-3-3σ在肾癌中作用呈负相关。