论文部分内容阅读
目的和意义:炎症性肠病(IBD)是一种顽固难治性的消化道疾病,严重时可累及全胃肠道,癌变率和病死率较高,近几年发病趋势明显上升。由于病因及发病机制远未阐明,进一步增加了临床治疗的难度。新近研究发现,CD4+CD25+ T细胞(Regulatory T cells,Tregs)在机体的免疫调节中具有至关重要的作用,其数量缺乏或功能缺陷可直接引起人和动物多种自身免疫性疾病的发生及炎症性疾病的出现。本课题用建立2,4-二硝基氯苯(DNCB)和醋酸(AA)复合法诱发的小鼠溃疡性结肠炎模型,研究Tregs在UC发病中的作用,并在此基础上,尝试使用某些中药有效成分进行UC的实验性治疗研究,不仅能进一步验证Tregs在UC发病中的重要作用,而且对于指导UC的临床有效治疗,也具有重要实际意义。材料与方法:采用清洁级KM小鼠,按体重随机分为正常对照、模型对照、柳氮磺氨吡啶治疗和中药复方1号治疗组共4组。首先建立2,4-二硝基氯苯和醋酸诱导的小鼠结肠炎模型;观察造模前后的临床症状,肠道积分法观察组织病理学变化;MGG和DAPI染色检测淋巴细胞凋亡指数的改变;流式细胞仪分析外周血和肠系膜淋巴结中CD4+CD29+ T细胞、CD3+、CD4+ T细胞的变化,验证模型的有效性和实用性。开展实验性治疗研究,建模后一周,正常和模型对照组均以等体积蒸馏水灌肠,SASP组以蒸馏水配制的SASP溶液灌肠,中药灌肠组以中药复方l号灌肠。给药1～2周,各组小鼠均于给药后1和2周处死,观察治疗前后临床症状的变化、结肠组织病理学改变,检测外周血和肠系膜淋巴结CD4+CD25+等T细胞亚群的变化。免疫组化染色检测造模前后以及治疗前后IL-1β和iNOS的表达;RT-PCR检测Foxp3 RNA的表达。实验结果:成功建立免疫型小鼠结肠炎模型,灌肠后1天,除正常对照组外各组均出现明显精神萎靡、懒动,体重明显下降。1-3天先后出现粘液便、粘液脓便及粘液血便。模型一周组,结肠病理变化主要集中在远端结肠,结肠缩短明显。病理变化包括结肠粘连、狭窄,近段结肠扩张。光镜下,粘膜表面明显充血水肿,糜烂和溃疡形成,隐窝脓肿形成,肠绒毛结构紊乱,杯状细胞减少甚至消失,大量中性粒细胞浸润,为急性炎症期表现。与正常对照组比较,模型组小鼠免疫组织淋巴细胞凋亡指数明显升高,尤以脾脏和淋巴结升高较为明显。(P< 0.01)。模型组小鼠CD4+CD29+ T细胞亚群的数量较正常对照组明显升高(P<0.01),而外周血和肠系膜淋巴结CD3+和CD4+ T细胞均出现降低,尤以CD4+降低较为明显(P<0.05)。经过SASP和中药灌肠治疗后小鼠临床症状明显减轻,组织学评分与模型对照组比较有明显统计学上的差别。特别是模型组结肠长度较正常对照组明显缩短,经两种药物分别治疗后结肠缩短程度明显减轻,接近于正常对照组。治疗一周组,大体未见肠腔明显扩张及粘连,结肠长度和对照组差别不明显。粘膜充血水肿减轻,糜烂溃疡未愈合,隐窝脓肿范围缩小,粘膜表面炎性细胞明显减少,淋巴细胞浸润仍在粘膜及粘膜下层。治疗两周组,结肠长度趋于正常,糜烂及溃疡基本愈合,隐窝及脓肿消失,粘膜及粘膜下层仍可见少量炎细胞浸润;肌层结构正常、增厚不明显,肠绒毛排列整齐,可见杯状细胞增生。经SASP治疗2周后,与模型对照组比较,外周血和肠系膜淋巴结中CD3+和CD4+ T细胞均出现有统计学意义的升高(P<0.01);经中药复方1号治疗2周后,上述两种T细胞均较模型组明显增加(P<0.05)。与正常对照组比较,模型组小鼠外周血CD4+CD25+ T细胞亚群降低非常显著(P<0.01)。而经SASP治疗1周(P<0.01,与正常和模型组比较)和2周(P<0.05,与模型组比较)、经中药复方1号治疗1周(P<0.05,与正常和模型组比较)和2周(P<0.01,与模型组比较;P<0.05,与正常组比较)后,小鼠外周血CD4+CD25+ T细胞亚群,均出现有显著或非常显著统计学意义的增高。与正常对照组比较,模型组小鼠淋巴结CD4+CD25+ T细胞亚群降低趋势与外周血非常相似(P< 0.05)。模型组小鼠结肠组织中IL-1β和iNOS较正常组织表达有明显增高。阳性表达细胞主要有中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等,阳性产物以胞质呈棕褐色为主,胞核也有少量着色。阳性细胞多集中于靠近肌层的粘膜固有层内,肠上皮细胞仅有少量阳性表达,粘膜内小血管内皮细胞也可见IL-1β和iNOS阳性表达。与模型对照组比较,治疗组小鼠结肠组织中仅见IL-1β和iNOS少量阳性表达产物。此外,与模型组比较,中药治疗后小鼠结肠组织Foxp3 mRNA可见明显阳性表达。结论:2,4-二硝基氯苯(DNCB)和醋酸(AA)复合法诱导的小鼠结肠炎模型,是一种较理想的研究IBD的动物模型,可成功用于炎性肠病发病及治疗机制的研究。具有较强免疫抑制作用的CD4+CD25+ Tregs细胞亚群在小鼠实验性溃疡性结肠炎的发病及病情发展中可能具有重要免疫调节作用。SASP和中药灌肠治疗后,能有效调控CD4+CD25+ Tregs细胞数量和功能的增加,一方面可通过有效抑制过度的免疫反应,另一方面可通过调节机体的免疫平衡,特别是肠道内的免疫失衡,维持机体内环境的相对稳定,从而达到有效治疗UC的目的。中药复方能够明显减轻UC小鼠肠道损伤的严重程度,其疗效可能是通过上调Foxp3的表达、调节肠内Tregs细胞数量和功能进而维持肠内免疫平衡等机制实现的。此外,增加的Tregs细胞能通过显著抑制NF-κB信号通路下游重要信号分子IL-1β和iNOS的表达,发挥其免疫调节和抗炎作用,可能是中药等有效治疗UC的重要分子机制之一。