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目的HIV-1新发感染检测是艾滋病防控工作中的一个重点、难点问题。在本研究中,我们优化重组抗原等核心组分和反应体系,研制了一种HIV-1新发感染检测试剂盒(重组捕获酶联免疫法,以下简称RCEIA试剂盒),并初步评价了该试剂盒的热稳定性、重复性、再现性和检测性能。方法1.HIV-1基因亚型样品盘的组建:取库存HIV-1阳性血浆样品,提取总RNA,反转录后经巢式PCR扩增HIV-1的pol、gag和env基因区片段。PCR产物测序后进行基因亚型分析,结合现有的其他已知亚型样品,组建包括我国常见HIV-1基因亚型的样品盘。2.重组抗原的制备和筛选:在HIV-1重组抗原(编号HIV-Ag-R03)的基础上,通过调整核心结构、改变表达载体、链接亲水氨基酸序列、更换蛋白标签等方式,构建、表达另外6种重组抗原。检测7种重组抗原对不同基因亚型样品的覆盖能力;标记辣根过氧化物酶(HRP)后,再次检测它们对不同基因亚型样品的覆盖能力,筛选出对不同基因亚型具有较好反应原性的酶标重组抗原备用。3.RCEIA试剂盒的组建和优化:筛选试剂盒核心组分,优化酶标重组抗原工作浓度等反应条件,制备校准品及对照品,组装试剂盒。4.RCEIA试剂盒的热稳定性、重复性、再现性和检测性能的初步评价:分别对试剂盒的核心组分和整个试剂盒进行热稳定性评价实验;通过孔间精密度实验、板间精密度实验以及初筛与确认试验的一致性和相关性分析,对试剂盒的重复性进行评价;利用本课题组前期建立的新发感染检测试剂评价血清盘BEDn81,通过两实验员检测结果的一致性和相关性分析,对试剂盒的再现性进行评价,并比较RCEIA试剂与BED试验、亲和力试验检测结果的符合率和相关性。结果1.HIV-1基因亚型样品盘的组建:组建了包含11种HIV-1基因亚型、由28份样品组成的基因亚型样品盘,编号为STn28。2.重组抗原的制备和筛选:获得6种纯度高且具有良好反应原性的重组抗原,利用HIV-1基因亚型样品盘STn28筛选出对所有基因亚型具有较好反应性的酶标重组抗原HIV-Ag-R07-HRP。3.完成HIV-1新发感染检测RCEIA试剂盒的组建。酶标重组抗原HIV-Ag-R07-HRP的最佳工作浓度为1:2000,高阳性对照、校准品、低阳性对照均由1份基因亚型为CRF07-BC的HIV-1阳性样品稀释而成,制备对照品和校准品所用稀释液和阴性对照均为HIV阴性混合血浆。4.RCEIA试剂盒的热稳定性:核心组分酶结合物可在37℃稳定至少7天,对照品和校准品可在37℃稳定至少7天。整个试剂盒可在37℃稳定至少7天,相当于在4℃可稳定1年。5.RCEIA试剂盒的重复性和再现性:孔间精密度好,高阳性对照、校准品和低阳性对照在同一块酶联板上检测的OD值变异系数均小于10%。板间精密度好,高阳性对照、校准品和低阳性对照的变异系数均小于15%。同一批样品初筛与确认试验结果的一致性和相关性好,样品检测OD值和ODn值的相关系数分别为0.989和0.997。在同一实验室使用同一批试剂盒检测同一批样品的条件下,两个实验员的检测结果再现性好,OD值和ODn值的相关系数分别为0.988 和 0.990。6.RCEIA试剂盒与BED试验、亲和力试验的比较:用3种试剂盒分别检测BEDn81血清盘,结果显示RCEIA试剂盒与BED试验的符合率为87.65%(Kappa=0.75,P=0.000),与亲和力试验的符合率为 85.19%(Kappa=0.68,P=0.000);RCEIA试剂盒检测结果与BED试验及亲和力试验的检测结果均具有较好的相关性,相关系数分别为0.904和0.892。结论1.筛选出一种经辣根过氧化物酶标记后对我国常见基因亚型具有较好反应原性的HIV-1重组抗原(编号HIV-Ag-R07),研制了 HIV-1新发感染检测RCEIA试剂盒。2.RCEIA试剂盒的热稳定性、重复性和再现性好,检测结果与BED试验和亲和力试验的符合率、相关性均较好。RCEIA试剂盒的核心技术参数(窗口期和假新近感染率)有待进一步研究。