目的：本课题针对流感病毒感染宿主机体的作用机制，利用分子生物技术、细胞生物技术构建用于抗流感病毒类药物筛选和评价的甲型H1N1流感假病毒模型，并对其应用进行探索。利用构建的流感假病毒模型系统评价流感免疫血清的中和效价、评价帕拉米韦氯化钠注射液和板蓝根药材提取液的抗流感病毒活性，从而为该类药物的研发建立了安全、有效的抗流感病毒检测方法。　　方法：　　方法一：甲型H1N1流感假病毒模型的构建　　1、重组表达质粒的构建：选择H1N1流感病毒亚型A/California/04/2009为模板，合成相应的血球凝集素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)全长cDNA序列，通过酶切和连接反应与pcDNA3.1+载体合成重组表达质粒，转化后进行重组表达质粒的扩增，采用测序、酶切及PCR等方法鉴定重组表达质粒构建成功。　　2、甲型H1N1流感假病毒制备：将pNL4-3.Luc.R-E-（简称pNL，下同）与重组表达质粒（HA与NA）或VSV-G（Vesicular Stomatitis Virus G，水疱性口炎病毒G蛋白）质粒共同转染至包装细胞，取细胞上清，过滤后即得甲型H1N1流感假病毒和 VSV-G假病毒。将获得的流感假病毒感染宿主细胞，检测宿主细胞内的荧光值。　　1）包装细胞的筛选:将pNL与HA、NA或VSV-G分别转染pheonix293细胞、293FT细胞和293T细胞后，通过检测转染细胞内荧光强度筛选适用于本研究实验体系的包装细胞。　　2）宿主细胞的筛选:将获得的流感假病毒感染MDCK细胞、A549细胞、293T细胞和HEK293细胞，通过检测被感染细胞内荧光强度筛选适用于本研究实验体系的宿主细胞。　　3、流感假病毒模型验证：将获得流感假病毒感染 HEK293宿主细胞，通过检测宿主细胞内荧光强度评价流感假病毒的感染活性。用WHO推荐抗流感病毒药奥司他韦及奥司他韦酸作为阳性药物，评价所构建的流感假病毒模型，证明流感假病毒模型构建成功。　　方法二：甲型H1N1流感假病毒模型的应用　　1、流感免疫血清中和效价评价：将流感假病毒与不同稀释比例流感病毒免疫血清（Influenza Anti-A/California/7/2009 HA Serum Sheep535，536，537，538）作用后，感染HEK293宿主细胞，通过检测宿主细胞内荧光强度评价免疫血清的中和效价。　　2、化学药物帕拉米韦抗病毒活性评价：依据帕拉米韦抗流感病毒作用机制，在假病毒生成阶段加入帕拉米韦，获得假病毒后，感染HEK293宿主细胞，通过检测宿主细胞荧光强度评价帕拉米韦对流感假病毒的抑制作用。　　3、中药板蓝根抗病毒活性评价：将流感假病毒与板蓝根药材提取液作用后，感染HEK293宿主细胞，通过检测宿主细胞荧光强度评价板蓝根药材提取液对假病毒的抑制作用。另外，通过经典鸡胚尿囊膜实验和NA酶活检测实验评价板蓝根药材提取液的抗流感病毒活性，与假病毒方法比较，进一步验证该方法在中药抗流感病毒药效中的作用。　　结果：　　结果一：甲型H1N1流感假病毒模型的构建　　1、转化后提取的重组表达质粒的酶切与PCR产物电泳条带在同一位置，目的条带的大小与预期条带大小一致，测序结果也与GenBank目的基因一致，证明重组表达质粒构建成功。　　2、3株包装细胞（293T细胞、pheonix293细胞和293FT细胞）的胞内荧光值检测结果显示，293T包装细胞内的相对荧光素酶活性（Relative Luciferase Activity， RLA）值比pheonix293细胞和293FT细胞的RLA值高，包装效率最高，确定293T细胞作为本研究实验体系的包装细胞。4株宿主细胞（293T细胞、MDCK细胞、A549细胞及HEK293细胞）的胞内荧光值检测结果显示，HEK293细胞的RLA值比293T细胞、MDCK细胞和A549细胞的RLA值高，易感性最好，确定HEK293细胞作为本研究实验体系的宿主细胞。同时，感染结果表明制备的假病毒具有感染流感易感细胞的能力（实验组RLA值和阴性对照组RLA值在统计学上具有显著性差异）。　　3、阳性药物评价实验的结果显示奥司他韦和奥司他韦酸对制备的流感假病毒的抑制率有剂量的依赖性，在1.00×10-10mol/L～1.00×10-5mol/L的剂量范围内，药物浓度与流感假病毒抑制率呈正相关，与病毒释放量呈负相关。奥司他韦和奥司他韦酸对假病毒模型的IC50分别为1.07×10-8mol/L和1.82×10-9mol/L，证明流感假病毒模型构建成功。　　结果二：甲型H1N1流感假病毒模型的应用　　1、血清中和实验结果显示制备的假病毒能够与甲型 H1N1流感病毒免疫血清发生中和作用，免疫血清的IC50在1:320～1:640之间，而对VSV-G假病毒基本无中和能力，证明制备的流感假病毒具有与流感病毒相似的生物学功能，该假病毒模型可用于流感病毒免疫血清的中和效价评价。2、假病毒模型评价化学药物帕拉米韦结果显示，模型阳性对照组 VSV-G假病毒的抑制率不受帕拉米韦影响，可以排除药物对本模型构建实验系统其他因素的影响；帕拉米韦对制备的流感假病毒的抑制率有剂量依赖性，在1.00×10-10mol/L～1.00×10-5mol/L的剂量范围内，药物浓度与流感假病毒抑制率呈正相关，与病毒释放量呈负相关。帕拉米韦对假病毒模型的IC50为2.00×10-11mol/L，该假病毒模型可用于抗流感病毒化学药帕拉米韦的药效评价。　　3、通过经典的鸡胚尿囊膜实验，将不同剂量的板蓝根药材提取液与流感病毒混合后接种至鸡胚，病毒活性被明显抑制。通过NA酶活性测定实验评价板蓝根药材提取液的抗流感病毒活性，NA酶活抑制率与板蓝根药材提取液浓度呈正相关，而抑制率转换成几率单位后，对数浓度与反应函数呈直线关系，回归方程Y(几率单位)＝6.822+1.9168×Log(浓度)，R=0.9748。板蓝根药材提取液对NA酶活具有抑制能力，量效关系呈线性关系。利用构建的流感假病毒模型评价板蓝根药材提取液的抗流感病毒活性，结果显示板蓝根药材提取液对所制备的H1N1流感假病毒具有抑制作用，且对假病毒RLA值的50％抑制浓度为10-5g/mL，而模型阳性对照组VSV-G假病毒的抑制率不受板蓝根药材提取液的影响。　　结论：　　1、成功构建了A/California/04/2009（H1N1）流感病毒亚型的重组表达质粒。　　2、确定了适用于本研究实验体系的包装细胞（293T）和宿主细胞（HEK293）。　　3、成功构建了甲型H1N1流感假病毒模型，并经阳性药给予验证确认。　　4、开展了流感假病毒的应用研究，该假病毒模型可用于流感免疫血清的中和效价评价、化药帕拉米韦和中药板蓝根的抗流感病毒活性评价。