丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus,HDV)是迄今首先发现的具有共价闭合环状负链RNA基因组的动物病毒。其毒粒直径35～37nm,为大小介于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的Dane颗粒和其表面抗原HBsAg颗粒之间的球形颗粒。病毒颗粒外层由脂双层和HBsAg组成,内含由HDAg和HDV RNA基因组结合组成的核蛋白体。嗜肝性病毒的表面蛋白对HDV病毒侵入和新HDV病毒颗粒的装配必不可少。　　 基因转运载体能将基因或其它核酸物质运载到细胞中,载体系统在生物技术中具有不可或缺的作用。根据载体的组成和制备过程可将基因转运载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中,利用病毒对宿主细胞的感染将外源基因导入细胞中。目前常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体等。用于基因治疗的病毒载体的靶向性可以通过包膜蛋白上的靶向性结合分子和组织特异性启动子的调控作用来实现。　　 HDV是一种特异性感染人及灵长类动物肝细胞的病毒,其生活周期需要HBV为其装配成感染性病毒颗粒提供包膜蛋白;HBV大表面抗原L-HBsAg中PreS的延长部分包含有肝细胞特异性结合位点,故HDV和HBV都具有肝细胞的亲嗜性。但是,HDV RNA的复制是在宿主细胞内RNA聚合酶的催化下完成的,该过程并不需要HBV的存在。鉴于以上特性,HDV可以改造成一种靶向肝细胞转运生物活性RNAs的特异性载体。有研究者采用57nt的非HDV序列取代了棒状结构一端的13nt的HDV序列,结果改造后的病毒的复制效率为20％,证明了改造后的病毒可以作为转运生物活性小RNA的载体工具。但是,将HDV改造成一种基因转运载体工具还需大量的实验研究。　　 目的:　　 筛选能够稳定表达L-HBsAg和S-HBsAg的细胞系,为HDV的体外装配提供包膜系统;构建含HDV cDNA多聚体的真核表达载体,体外研究HDV基因组的复制及装配,为肝细胞特异性丁型肝炎病毒载体的构建提供理论和实验基础。　　 方法：　　 1.包膜蛋白真核表达载体的构建:以pGEMT-HBV为模板,PCR扩增编码S-HBsAg和L-HBsAg的基因片段,然后连接到pGEM-T载体上,得到重组载体pGEMT-S和pGEMT-LS。利用ApaⅠ和NotⅠ分别酶切pGEMT-LS与pcDNA3.1(-)、pGEMT-S与pBSK,目的片段回收后利用T4连接酶连接后得到pcDNA3.1-LS和pBSK-S。利用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pBSK-S和pcDNA4/His MaxA,目的片段回收后利用T4连接酶连接得到重组载体pcDNA4-S,最后分别采用质粒PCR和酶切验证重组载体的正确性。　　 2.稳定细胞系的筛选:利用脂质体转染的方法将pcDNA3.1-LS转入HepG2细胞,48小时后利用G418进行压力筛选,阳性克隆经细胞计数后以单细胞的形式移至96孔板内扩大培养,筛选得到的稳定细胞系经RT-PCR和SDS-PAGE检测;pcDNA4-S质粒通过脂质体转染入经鉴定后稳定表达有L-HBsAg的HepG2细胞,采用Zeocin进行压力筛选预期得到能够同时稳定表达L-HBsAg和S-HBsAg的稳定HepG2细胞系。　　 3.重组HDV真核表达载体的构建:通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切位点,pcDNA3.1-D2载体中的HDV二联体的连接入pUC19克隆载体从而得到pUC19-D2;采用HindⅢSacⅠ双酶切位点,pUC19-D2中的HDV二联体分别重组入pEGFP-N1和pEGFP-C1载体,得到含有EGFP标签的重组载体pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2。　　 4.HDV体外复制研究:利用脂质体转染方法将重组HDV真核表达载体转入293T细胞,通过荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在转染细胞内的表达,收集转染后细胞分别提取RNA和蛋白进行荧光定量PCR和EUSA检测丁型肝炎病毒基因的表达。　　 结果：　　 1.经PCR、酶切和测序鉴定重组载体,pcDNA3.1-LS和pcDNA4-S重组真核表达载体构建成功:　　 2.pcDNA3.1-LS转染HepG2细胞后,利用900μg/ml的G418筛选14天后获得了阳性细胞克隆,经PCR以及SDS-PAGE鉴定的HepG2细胞稳定表达有L-HBsAg。在此基础上,利用800μg/ml的Zeocin筛选同时稳定表达L-HBsAg和S-HBsAg的细胞系未获成功;　　 3.经PCR和酶切鉴定重组载体,证明成功构建了同时表达有HDV二联体以及EGFP标签的pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2重组载体;　　 4.携带EGFP标签的重组HDV载体在293T细胞中能够表达EGFP,但强度较pEGFP-N1对照组要弱;pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2转染293T细胞后能够在体外起始HDV基因组的复制。经荧光定量PCR分析目的基因的表达量为105copies/μl,其水平与pSVL-D3和pcDNA3.1-D2相当;但是对HDAg的ELISA分析显示细胞内HDAg的表达量较低。　　 结论：　　 经实验研究证实,利用脂质体转染的方法获得了稳定表达有HBV L-HBsAg的HepG2细胞系,但是同时利用两种抗生素进行稳定细胞系的筛选还需进一步优化实验方案来验证。　　 本实验成功构建了含有EGFP的重组HDV真核表达载体,并利用脂质体法将重组载体转入293T细胞,通过观察绿色荧光、荧光定量PCR和ELISA检测等方法分析证实了重组HDV载体能够在细胞内起始HDV基因组的复制,为肝细胞特异性丁型肝炎病毒载体的研究提供了理论和实验基础。