宫颈癌是全球女性常见恶性肿瘤和癌症相关死亡原因之一,严重危害妇女健康。宫颈癌也是迄今病因最为明确的肿瘤,高危人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HR-HPV)持续感染是官颈癌发病的必需因素。但妇女一生中发生生殖道HPV感染的几率高达80%,大部分在HPV感染后2年内便自行消退,仅5-10%呈持续感染状态,而发生宫颈癌的几率不足1%。另外,大量研究表明采用单纯靶向HR-HPV关键致癌蛋白E6/E7表达的各种方法均不能完全阻遏宫颈癌细胞的恶性表型,迄今尚无治疗性HPV疫苗问世。由此可见,HR-HPV的感染结局取决于病毒和宿主的两个方面,只有从病毒与宿主交互影响入手,方能阐明病毒致癌过程的关键环节与关键分子,从而为包括官颈癌在内的各种HPV相关癌症开启全新的防治策略。非编码微小RNA(microRNAs, miRNAs)参与调控人类近1/3基因的表达。miRNAs是一类非编码的单链小分子RNA,主要通过与靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)互补结合,在转录后水平调控靶基因的表达,参与机体的生长、发育、分化、代谢和死亡等几乎所有重要的生理过程。近年的研究进一步证实,miRNAs具有抑癌基因或癌基因的功能,参与肿瘤的发生和发展过程,并在病毒感染性疾病中影响病毒的感染、清除和复制等过程。与基因网络和蛋白网络相比,miRNAs作为一种新的强有力的工具,在阐明发病机制和确定治疗靶点的研究中更具独特优势。因此,将miRNAs作为切入点进一步研究很可能为揭示HR-HPV致官颈癌发生发展的分子机制带来新的突破。在我们以往检测的HPV阴性正常官颈组织和HPV16阳性官颈癌组织的高通量miRNA表达谱芯片中发现,miR-424在官颈癌组织的表达较正常官颈组织明显下降。虽然关于miR-424的研究较少,但其功能比较明确,对细胞分化、增殖、周期和血管生成均有调控作用,而恶性肿瘤的发生往往表现为这些细胞功能的失调控。为了确定miR-424在宫颈癌发生发展过程中的作用和调控机制,本研究首先通过组织验证、临床病理参数分析和细胞功能验证确定miR-424在宫颈癌中的作用；其次通过靶基因确定和针对靶基因的组织和功能研究明确miR-424发挥生物学功能的机制；然后分析并寻找引起miR-424表达失调的基因或可能存在的调控环路；最后探讨miR-424在官颈癌中的表达抑制与HPV16癌蛋白间的关系。本研究旨在揭示宫颈癌发生发展的新机制,并为探寻宫颈癌防治新策略提供实验证据。第一部分miR-424在宫颈癌中的表达及功能目的：验证miR-424在官颈癌组织中表达下降,分析miR-424与宫颈癌临床病理参数间的相关性及明确miR-424对宫颈癌细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的调控作用。方法：收集官颈正常上皮组织和官颈癌组织标本,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR, qRT-PCR)法检测74例宫颈正常上皮组织和147例宫颈癌组织的miR-424表达水平,同时整理完整的临床病理资料,分析miR-424的表达与宫颈癌临床病理参数的相关性。利用细胞转染技术分别在官颈癌细胞株SiHa和CaSki中转染miR-424模拟物(mimic)或模拟物阴性对照,MTT法检测肿瘤细胞的增殖能力、BrdU联合7AAD法动态监测各组细胞周期分布、Annexin-V联合PI法检测细胞凋亡、划痕实验检测细胞的迁移能力和Transwell联合matrigel实验检测细胞的侵袭能力。结果：1.miR-424在官颈癌组织中的表达较宫颈正常组织显著下调。2。miR-424表达水平与官颈癌预后不良相关的临床病理参数,如细胞分化、FIGO分期、淋巴结转移、深间质浸润和脉管浸润均呈显著负相关。3.宫颈癌细胞株SiHa和CaSki中恢复miR-424的表达能抑制肿瘤细胞的增殖能力,促使细胞周期发生G1/S期阻滞和促进细胞早期凋亡,同时细胞的迁移和侵袭能力均受到明显抑制。结论：1.miR-424表达在宫颈癌组织中显著下降,并与官颈癌不良预后因素密切相关。2.miR-424抑制宫颈癌细胞增殖、诱导细胞周期G1/S期阻滞和促进细胞凋亡,并抑制细胞迁移和侵袭能力,提示miR-424在宫颈癌发生发展过程中发挥抑癌作用。第二部分miR-424通过靶向细胞周期检查点激酶1(Chkl)参与宫颈癌进展目的：确定miR-424发挥功能的靶基因,揭示miR-424在宫颈癌中的作用机制。方法：首先,分别在宫颈癌SiHa和CaSki细胞中高表达1miR-424,qRT-PCR检测ChklmRNA的表达水平,western blot检测Chk1及其活性蛋白p-Chkl (Ser345)的蛋白表达水平。其次,双荧光素酶报告基因检测联合定点突变法确定miR-424对Chkl的直接靶向作用。然后,利用siRNA特异性干扰宫颈癌细胞中Chk1的表达,western blot检测金属蛋白酶MMP9的表达,MTT法检测肿瘤细胞的增殖能力、BrdU联合7AAD法动态监测细胞周期分布、Annexin-V联合PI法检测细胞凋亡、划痕实验检测细胞的迁移能力和Transwell实验检测细胞的侵袭能力。最后,在已检测过miR-424表达水平的同一批官颈组织标本中采用免疫组织化学法检测Chkl和p-Chk1的蛋白表达水平及与宫颈癌临床病理参数的关系,并分析与miR-424的组织相关性。利用western blot法在另外收集的20例宫颈正常组织和40例宫颈癌组织中再次验证Chkl和p-Chkl的蛋白表达水平。在宫颈癌组织中分析Chkl、p-Chk1和MMP9的组织相关性及与淋巴转移的关系,明确Chkl在宫颈癌进展中的作用和调控分子。结果：1.miR-424高表达抑制Chkl和p-Chk1的蛋白表达水平,但不影响Chkl的mRNA水平。2.miR-424与含Chk13’UTR区的报告基因质粒共转染,可下调荧火虫酶的活性,但将Chkl3’UTR上miR-424的识别位点进行点突变后再与miR-424共转染,荧火虫酶的活性不受影响。3.干扰宫颈癌细胞Chkl的表达可抑制MMP9的蛋白水平,细胞增殖能力受阻,阻止细胞进入S期,细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡水平增加,细胞的迁移和侵袭能力均受抑制。4.Chkl和p-Chkl在宫颈癌组织中的表达水平均较官颈正常组织明显增高,且与多项官颈癌预后不良相关的临床病理参数呈显著正相关,与miR-424水平呈显著负相关。宫颈癌组织中,Chk1、p-Chkl和MMP9的表达呈显著正相关,三者在淋巴结阳性的官颈癌组织中的表达均较淋巴结阴性的宫颈癌组织明显增高。结论：1.miR-424直接靶向Chkl,并抑制p-Chk1的表达,提示Chkl是介导miR-424调控官颈癌细胞生物学功能的主要效应分子。2.Chkl可能通过转化为活性蛋白p-Chk1和正向调控MMP9的表达来促进官颈癌细胞的侵袭转移能力。3.Chkl和p-Chk1高表达与宫颈癌不良预后因素密切相关。第三部分Cul2/E2F1/miR-424调控环路引起宫颈癌细胞miR-424持续性表达抑制目的：证明在宫颈癌细胞中存在Cul2/E2F1/miR-424调控环路,及其对miR-424表达的调控,从而揭示宫颈癌细胞中miR-424持续性表达失调的原因。方法：siRNA干扰宫颈癌SiHa细胞中E2F1的表达,qRT-PCR检测miR-424的表达情况。化学合成miR-424基因的转录起始位点上游2000bp序列,克隆到PGL3-Basic载体,再将miR-424启动子区上E2F1的两个识别位点分别进行逐一缺失突变和联合缺失突变,双荧光素酶报告基因检测miR-424启动子活性的改变。分别共转染E2F1siRNA和miR-424启动子区、不同突变位点的miR-424启动子区,检测miR-424启动子活性情况,明确E2F1对miR-424启动子区具体位点的直接调控作用。采用染色质免疫共沉淀(ChIP)法,针对miR-424启动子区E2F1的可能识别位点设计特异性引物,将免疫磁珠法富集抗体复合物后解联释放并纯化的DNA片段进行普通RT-PCR验证,再次明确E2F1对miR-424启动子区特定位点的结合。宫颈癌SiHa细胞高表达miR-424, qRT-PCR和western blot分别检测Cul2mRNA和蛋白的表达水平,双荧光素酶报告基因检测联合定点突变法确定miR-424对Cul2的直接靶向作用。SiHa细胞转染Cul2siRNA和Cul2表达质粒,qRT-PCR检测正反调控Cul2后miR-424的表达改变,western blot检测E2F1的表达情况。构建HA标记的Cul2表达质粒,瞬时转染293T工具细胞,收集蛋白进行免疫共沉淀(Co-IP),验证Cul2与E2F1的结合情况。SiHa细胞转染E2F1siRNA和E2F1表达质粒,进行western blot实验,从正反两方面验证E2F1通过miR-424间接影响Cul2的表达。SiHa细胞转染miR-424mimic, qRT-PCR和western blot检测E2F1mRNA和蛋白的表达水平,验证miR-424通过调控Cul2间接影响E2F1的表达。SiHa细胞分别转染Cul2siRNA、Cul2表达质粒、E2F1siRNA和E2F1表达质粒,CCK8法和ki-67免疫荧光法检测Cu12和E2F1对细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：1. SiHa细胞干扰E2F1的表达可引起miR-424的表达上调,荧光素酶报告基因检测和ChIP实验结果显示E2F1结合miR-424启动子区的两个E2F1识别位点直接抑制miR-424的启动子活性。2. SiHa细胞高表达miR-424促使Cul2mRNA和蛋白表达均受抑制,荧光素酶报告基因显示miR-424能直接靶向Cul23’UTR区。SiHa细胞正向或反向调控Cul2的表达,可反馈性引起miR-424出现下调或上调表达,而miR-424的上游分子E2F1的表达水平与Cu12的表达同向改变。免疫共沉淀结果显示Cu12能与E2F1结合。3. SiHa细胞正向或反向调控E2F1的表达,Cu12蛋白表达出现同向改变。高表达miR-424可引起E2F1表达下降。4.分别正反两方面调控Cu12和E2F1的表达,Cu12和E2F1均能促进SiHa细胞的增殖能力,ki-67增殖标记分子表达增加,加速细胞周期从G1期过渡到S期。结论：1.E2F1是miR-424的直接上游分子,抑制miR-424的表达。2.在宫颈癌细胞存在Cul2/E2F1/miR-424反馈环路,该环路的调控结果导致miR-424出现持续性表达抑制。第四部分miR-424与高危人乳头瘤病毒16早期癌蛋白E7的关系探讨目的：确定HPV16早期癌蛋白E7对miR-424的调控作用和机制。方法：采用qRT-PCR法检测HPV阴性宫颈正常上皮组织、单纯HPV16感染的宫颈正常上皮组织、单纯HPV16阳性CINII-III和单纯HPV16阳性宫颈癌中的miR-424和HPV16E7的表达,并分析两者的组织相关性。SiHa细胞过表达miR-424,qRT-PCR检测HPV16E7的mRNA表达水平。SiHa细胞分别转染HPV16E7表达质粒和HPV16E7siRNA, qRT-PCR检测调控HPV16E7后miR-424的表达改变。HA标记的HPV16E7表达质粒转染293T工具细胞,免疫共沉淀检测HA-E7与E2F1的结合情况。HA标记的HPV16E7表达质粒和Cul2表达质粒共转染293T工具细胞,免疫共沉淀检测HA-E7与Cul2的结合情况。SiHa细胞分别转染HPV16E7表达质粒和HPV16E7siRNA, western blot检测HPV16E7对E2F1和Cul2的表达调控。结果：1.miR-424在HR-HPV阴性官颈正常组织、单纯HPV16感染宫颈正常组织、单纯HPV16感染CINII-III和单纯HPV16感染宫颈癌组织中表达逐级下降,而HPV16E7的表达随着病变进展逐级增高,相关性分析结果显示与miR-424的表达呈明显负相关。2. SiHa细胞高表达miR-424不能引起HPV16E7的mRNA表达水平改变,相反,正向和反向调控HPV16E7的表达,miR-424的表达水平出现相应的下降和上升。3. HPV16E7能与E2F1直接结合,并同向调控E2F1的表达。4. HPV16E7能与Cul2结合,但不调控Cul2的表达。结论：1.在单纯HPV16感染官颈病变中,miR-424表达与病变程度及HPV16E7表达呈负相关,提示miR-424与宫颈癌的发生密切相关。2.miR-424不调控HPV16E7的表达。3. HPV16E7分别通过结合并调控E2F1表达和结合Cul2抑制miR-424表达。