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本研究利用碳化二亚胺(EDC)法将氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)与匙孔嘁血蓝蛋白(mcKLH)偶联制备免疫原,免疫Balb/c 小鼠,同上方法将氨苄青霉素连接到阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)上制备包被抗原,利用间接酶联免疫吸附法(ELISA)对Amp-KLH 偶联物免疫小鼠产生的抗体进行检测,并建立了对Amp 的ELISA 检测方法。Amp 免疫原(Amp-KLH)中半抗原与载体蛋白的偶联比为30:1,包被原(Amp-BSA)中半抗原与载体蛋白的偶联比为10:1。抗血清效价为2×105。应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,建立分泌氨苄青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对杂交瘤细胞培养上清的检测、鉴定,筛选出8 株高亲和力的杂交瘤细胞株2A6、2G6、2A10、2B8、3D12、3E12、4E1、4D12,通过效价测定、对药物的抑制率及稳定性等试验筛选出3D12 株杂交瘤细胞进行下一步试验。用其制备的腹水间接ELISA 效价达到2×106 ,杂交瘤细胞染色体数目为97-104 条,3D12 株亚型为IgG2a,抗体分子量为154KD,亲和常数为3×10-10mol/L。该单抗与氨苄青霉素-钠、青霉素-钠交叉反应率分别为0.36%、0.0065%,头孢拉定、头孢噻呋及其它常用抗生素卡那霉素、链霉素、磺胺嘧啶、庆大霉素的交叉反应率均小于0.001%,该细胞株经体外培养、传代、冻存和复苏后抗体性质稳定。用方阵滴定法确定包被原最适工作浓度为2μg/ml,单抗的最适稀释倍数为1:50000,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(简称酶标二抗)最适稀释倍数为1:5000。采用间接竞争ELISA 方法建立检测Amp 的标准曲线,在0.5ng/ml～100ng/ml 范围内呈线形相关,回归方程为Y=0.0569X+0.1308,相关系数R2=0.9948,以10%抑制率对应的浓度计算,该方法对Amp 的检测限为0.3ng/ml,对市售消毒纯牛奶最低检测限为0.4ng/ml。用该单抗进行牛奶中氨苄青霉素酶联免疫检测试剂盒的研制。