目的:外耳道真菌病是外耳道皮肤的一种浅表性真菌感染性疾病,临床非常多见。其病原真菌鉴定多依赖于以培养为主的形态学分类方法,但常面临菌种难以培养、检出率低、鉴定者主观性强等不足,导致延误诊断,影响后续治疗,甚至引发严重的并发症。目前,本病的治疗以广谱抗真菌药物外用为主,然而本病易于反复,迁延难愈,对患者造成很大困扰,长期使用抗菌药物可导致耐药及外耳道菌群失调。因此,寻找疗效确切、毒副作用小的非抗菌药物成为本病亟需解决的问题。本研究采用ITS测序技术探索外耳道真菌病的真菌群落构成,鉴定主要病原真菌,旨在引导及时、准确的诊断;同时结合体外抑菌实验与临床症状、体征评分,对一种中药组合物桉芩耳用喷剂治疗外耳道真菌病进行疗效评价,并结合急性毒性实验与皮肤刺激性实验研究评价其安全性。方法:1.临床研究:招募2020年5月～2021年4月期间就诊于江苏省中西医结合医院耳鼻喉科门诊并符合外耳道真菌病纳入标准的患者20例（共28患耳）,随机分为两组,治疗组/A组10例（共14患耳）,对照组/B组10例（共14患耳）,另招募健康受试者10例（健康组/C组,共20耳）。所有患者均于治疗前先行外耳道分泌物采样,清理外耳道后再外用药物治疗。A组予以桉芩耳用喷剂喷耳,一次1喷/耳,一日1次;B组予以联苯苄唑溶液喷耳,一次1喷/耳,一日1次。疗程为2周,记录用药前、用药第7天与用药第14天耳痒、耳闷、耳痛及听力下降等症状、体征评分,进行临床疗效评定,并记录不良反应发生情况,治疗结束后随访2月,观察有无复发及不良反应。健康受试者仅行外耳道分泌物采样作为对照。2.真菌鉴定、菌群构成及多样性分析:①显微镜检查:将上述采样拭子行分泌物涂片及革兰氏染色,于显微镜下观察;②真菌培养:将采样拭子于沙保罗琼脂平板上行四区划线,置于28℃恒温箱培养2～4天,肉眼观察菌落生长情况,采用透明胶带法行乳酸酚棉蓝染色,再次镜检记录初步鉴定结果;③ITS测序分析:所有采样标本经DNA提取、PCR扩增及文库构建,利用Illumina平台进行真菌rDNAITS序列高通量测序分析。经QIIME数据除杂、OTU聚类分析、比对Unite真菌数据库,获取真菌群落构成信息。基于Mothur的稀疏度分析对所得数据进行α多样性分析,包括覆盖度（Good’s coverage）、丰富度（Chao1）及多样性（Shannon、Simpson）指数等。使用 UniFrac进行β多样性分析,基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析（PCoA）及相似性分析（ANOSIM）进行样本间多样性指数的统计学差异比较。另外,生成症状、体征与真菌菌属的Heatmap数据。通过LEfSe分析鉴定样本中的真菌物种,使用Kruskal-Wallis秩和检验分析样本间的变化和差异,采用线性判别分析（LDA）确定各组显著丰富的真菌类群。3.桉芩溶液体外抑菌实验研究:将培养所得的病原菌株①（培养于28℃恒温箱）、菌株②（培养于35℃恒温箱）及采购标准菌株③（土曲霉Aspergillus terreus）活化后制备菌悬液,采用微量二倍稀释法测定桉芩溶液及联苯苄唑溶液对实验菌株的最小抑菌浓度（MIC）,制备含药培养基,比较点样接种法与菌块接种法的可行性,选择合适的方法接种实验菌株,采用十字交叉法测量菌落直径,计算桉芩溶液及联苯苄唑溶液对实验菌株的抑菌率,采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。4.桉芩溶液安全性动物实验研究:①急性毒性实验:对SD大鼠行外耳道给药,以生理盐水作对照,观察其精神状态及活动情况、摄食摄水、大小便、耳部皮毛、外耳道皮肤及鼓膜情况,给药前、后分别行血常规及血生化检测,7天后取大鼠外耳道皮肤及鼓膜,行病理学检查;②皮肤刺激性实验:对新西兰兔背部皮肤两侧对称脱毛后给药,以生理盐水作对照,记录皮肤刺激性评分、评价皮肤刺激性强度,并取其背部皮肤行病理学检查。结果:1.临床观察:受试者用药第7天和第14天,A组与B组症状、体征总评分明显降低（P＜0.05）,各症状、体征明显缓解（P＜0.05）,用药7天后两组总有效率分别为78.57%、64.29%,用药14天后两组总有效率均为100%,治疗后2月A组患者3耳复发,该组总评分均值0.93分,B组患者7耳复发,该组总评分均值2.38分,两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者用药期间均未出现明显不良反应。2.显微镜检查及真菌培养:A组与B组治疗前镜下均可见散在的真菌菌丝或孢子,其中,A组14个样本与B组12个样本经培养后形成沙土色、浅褐色或灰黄色的颗粒状菌落,经乳酸酚棉蓝染色后可观察到曲霉菌的典型形态,C组未观察到真菌菌丝或孢子,培养亦未见真菌菌落生长。3.真菌群落构成及多样性分析:（1）患病组（A组与B组）样本治疗前观察到的OTU数量低于治疗后及健康组,Chao1、Shannon指数亦低于治疗后及健康组,Simpson指数则升高,说明与健康外耳道相比,外耳道真菌病患者的真菌种类丰富度和多样性下降,并在治疗后回升。（2）基于Bray-Curtis距离的PCoA显示:患病组治疗前、后样本菌群存在差异（P＜0.05）,且相比于治疗前,治疗后样本菌群逐渐趋向于健康组（P＞0.05）。（3）在门水平上,患病组治疗前以子囊菌门占主导,治疗后子囊菌门丰度下降、担子菌门丰度攀升,健康组则以担子菌门占优势。（4）在属水平上,曲霉菌是患病组治疗前样本的优势菌属,在A组13个样本及B组11个样本中丰度＞80%,在9个样本中丰度甚至＞99%。治疗后样本中曲霉菌丰度下降、马拉色菌丰度升高,部分甚至反超曲霉菌而占据主导地位,在10个样本中马拉色菌的丰度＞80%。马拉色菌在健康组20个样本中丰度均＞80%,在3个样本中丰度甚至＞99%,占据均对优势。此外,患病组样本中还检测到较高丰度的Sagenomella、枝孢霉菌和青霉菌,健康组样本中还检测到Pseudomicrostroma和链格孢菌。（5）真菌菌属与症状、体征的相关性研究表明,曲霉菌属与症状、体征呈正相关,马拉色菌属与之呈负相关,其他多数菌属与症状、体征的相关性波动较大。鉴定结果表明:显微镜检查及真菌培养鉴定结果为:患病组样本主要病原菌为曲霉菌（26/28）,余2个样本无法鉴定,C组无法鉴定真菌种类;ITS测序鉴定结果为:患病组主要病原菌为曲霉菌（28/28）,C组主要常驻菌为马拉色菌（20/20）。二种方法鉴定结果基本一致,后者检出率更高,可提供信息更全面。4.桉芩溶液体外抑菌实验:（1）桉芩溶液对实验菌株①、②的MIC均为12.5μg/ml,对标准菌株③的MIC为50μg/ml,联苯苄唑溶液对实验菌株①、②的MIC均为25μg/ml,对标准菌株③的MIC为100μg/ml。（2）桉芩溶液含药培养基对菌株①、②及③培养2天的抑菌率分别为（86.10±0.90）%、（80.10±11.60）%及（70.30±14.00）%;4 天后的抑菌率分别为（60.40±7.40）%、（53.80±13.00）%及（32.00±5.20）%;6 天后的抑菌率分别为（48.00±5.30）%、（46.60±9.60）%及（22.70±4.90）%。5.桉芩溶液安全性动物实验:实验组大鼠未出现全身急性毒性反应,外耳道皮肤病理切片结果未见明显异常,部分大鼠鼓膜病理切片结果显示轻-中度水肿,与对照组结果相似;新西兰兔背部皮肤未出现明显红斑及水肿,组织病理切片亦未见明显异常。结论:1.曲霉菌是外耳道真菌病的主要病原真菌,Sagenomella、枝孢霉菌和青霉菌也可能是本病的病原真菌;马拉色菌是健康外耳道的主要常驻真菌。2.外耳道真菌病的真菌群落构成与健康外耳道存在差异,患者外耳道的真菌种类丰富度和多样性较健康外耳道下降,并于治疗后回升。3.与传统形态学方法相比,ITS测序对外耳道真菌病的鉴定结果更准确、丰富,检出率更高,可帮助临床医师全面了解外耳道真菌病患者的真菌群落构成,并有助于评估抗真菌药物的疗效。4.桉芩耳用喷剂可通过抑制曲霉菌调节外耳道真菌群落构成及菌群多样性,改善外耳道真菌病的临床症状与体征,从而达到治疗的目的,其临床疗效与联苯苄唑溶液相当,治疗14天更佳,2月后疗效相似,复发率较低,无明显不良反应。在体外对曲霉菌（土曲霉）也具有一定的抑菌作用,且无明显急性毒性和皮肤刺激性,安全性较高。