疫霉属于卵菌,其中许多能够引起植物的毁灭性病害,如大豆疫霉为害大豆引起大豆疫霉根腐病。作为一种典型的半活体营养病原菌,大豆疫霉在侵染早期需要寄生于活体细胞来汲取营养,待侵染后期杀死寄主从而转化为死体营养,在整个过程中,病原菌利用复杂的分子机制来调控与寄主的相互作用。随着大豆疫霉基因组测序的完成,分析发现其基因组编码大量的效应因子,其中包括近400个RxLR类效应因子。尽管一些RxL R类效应因子已被发现能够抑制植物的防卫反应,但绝大部分效应因子在侵染过程中的生物学功能及其作用机制仍然未知。疫霉菌与真菌具有不同的进化关系,在致病机制方面显著的不同是疫霉菌分泌大量的RxLR类效应因子。然而,疫霉菌众多效应因子中是否存在功能冗余或者是否大部分单个效应因子都能够决定病原菌的致病性尚且未知。基于实验室前期的Micro Array数据,本研究进一步对RxLR类效应因子进行了侵染阶段的转录分析,选取了 17个在疫霉菌侵染早期上调表达的基因。将体外合成的double-stranded RNA(dsRNA)通过PEG介导的原生质体转化方法转入大豆疫霉(P6497)细胞中,介导候选效应因子基因的瞬时沉默,并分析沉默突变体的致病性。我们共沉默并测试了 17个侵染阶段高表达的效应因子。实验结果发现其中13个RxLR效应因子的基因沉默分别导致了大豆疫霉不同程度的致病能力丧失,表明这些侵染过程中转录上调的效应、因子对大豆疫霉致病能力的重要性,也说明了疫霉菌众多效应因子中大部分单个效应因子都能起到对病原菌致病性的决定作用。病原菌在与植物的协同进化中,RNA沉默是植物、真菌以及无脊椎动物等抵御病毒侵染的重要机制。本实验室前期发现大豆疫霉两个RxLR效应因子(PSR1和PSR2)具有植物RNA沉默抑制子的活性,其中PSR2通过特异性抑制植物的tasi-RNAs来发挥作用。本研究在前人对PSR2进行瞬时沉默的基础上进一步进行稳定沉默,明确了PSR2也是大豆疫霉致病必需的效应因子之一。此外,Kuan等进一步分析可能影响PSR2功能的植物蛋白,本研究针对候选蛋白进行基因表达的分析,结果显示目标基因在野生型大豆疫霉侵染大豆过程中上调表达,而沉默PSR2的大豆疫霉侵染过程中转录则不再变化。通过对PSR2蛋白结构域的解析,我们发现PSR2具有5个完整的W-Y-L元件和2个靠近两端的不完整元件,实验表明位于两端的两个不完整元件和靠近C端的1个完整的W-Y-L元件对其RNA沉默抑制活性是必需的,但单独缺失上述任何一部分元件均对PSR2蛋白的亚细胞定位没有影响。综上所述,本研究利用大豆疫霉的瞬时转化对17个在疫霉菌侵染大豆过程中上调表达的RxLR效应因子进行沉默,研究结果说明了疫霉菌中大部分单个效应因子都能对病原菌致病性起到决定作用。此外,对具有植物RNA沉默抑制子活性的RxLR效应因子PSR2进行深入研究,明确了 PSR2也是大豆疫霉致病必需的效应因子之一,并鉴定了决定PSR2蛋白维持RNA沉默抑制子活性的关键功能域。本研究对理解疫霉菌众多效应因子存在的生物学意义以及效应因子功能域与功能之间的关系具有重要价值,为深入研究效应因子的功能提供了重要知识。