多糖(polysaccharide)是生物体内普遍存在的一类高分子化合物,具有许多重要的生理功能。多糖的药用研究始于1943年,60多年来,人们从动物、植物、微生物中提取分离了大量活性多糖,发现多糖具有促进机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老、抗骨髓抑制和抗辐射等一系列作用,在临床上已用于治疗肝炎、艾滋病、癌症和许多其它疾病。免疫活性多糖因其来源广泛、效果确切、毒副作用小等受到了普遍重视。开口箭(Tupistra chinensis Baker)又名牛尾七、竹根七等,主要分布于我国西南地区,民间主要用于治疗咽喉肿痛、风湿痹痛、跌打损伤、胃痛、毒蛇狂犬咬伤、蚊虫叮咬等。开口箭属植物主要活性成分为皂苷,从该属植物根茎中已分离提纯出多种皂苷成份。研究发现,开口箭具有良好的抗炎作用,有良好的开发利用价值。皂苷是其抗炎的重要物质基础之一,抑制炎症介质PGE2、NO的产生是其作用机理；开口箭皂苷体外对HL-60、Caski、251肿瘤细胞具有明显的抑制作用,体内外对S180肉瘤细胞也有很强的抑制作用；同时开口箭皂苷还能够抑制血小板的聚集与活化。也有研究报道,开口箭水提物能明显抑制炎症早期的水肿和渗出,具有抗炎镇痛的功效。我们在活性筛选时发现,开口箭水提物具有一定的免疫活性,从而引起了我们的研究兴趣。本文对分离得到的开口箭多糖组分TCBPⅡ(Tupistra chinensis Baker polysaccharidesⅡ, TCBPⅡ)的免疫调节作用及其机制进行了初步研究。目的：1.提取分离开口箭粗多糖并筛选出活性成分。2.研究开口箭多糖(TCBPⅡ)体外对正常小鼠脾细胞代谢MTT活力及产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)的影响；体外对正常小鼠腹腔渗出细胞代谢MTT活力及产生TNF-α的影响；体内对正常小鼠迟发型超敏反应(DTH)、血清溶血素水平的影响。3.研究开口箭多糖(TCBPⅡ)体内对环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的DTH、单核巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素水平的影响。4.研究开口箭多糖(TCBPⅡ)对荷S180实体瘤小鼠抑瘤作用、血清TNF-α、IFN-γ含量及腹腔单核巨噬细胞吞噬功能的影响。方法：1.采用热水提取、乙醇沉淀法从开口箭植物的根茎中提取粗制多糖,再用Sevage法去蛋白。经DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换柱对粗制多糖进行分离纯化,得到不同组分开口箭多糖。通过测定不同组分多糖对正常小鼠脾脏淋巴细胞增殖作用筛选出活性成分,命名TCBPⅡ2.取正常小鼠脾细胞,加入开口箭多糖(TCBPⅡ),在37℃下培养48h,收集培养上清,用ELISA方法检测其中TNF-α、IFN-γ、IL-2的含量,或者用MTT比色法检测细胞代谢MTT活力。3.取正常小鼠腹腔渗出细胞,加入开口箭多糖(TCBPⅡ),在37℃下培养10h,收集培养上清,用ELISA方法检测其中TNF-α的含量,或者用MTT比色法检测细胞代谢MTT活力。4.正常小鼠50只,随机分为5组,生理盐水对照组、阳性药物(灵芝多糖100mg/kg)组、TCBPⅡ低、中、高剂量(50,100,200mg/kg)组,给药组小鼠分别连续腹腔注射(ip)干预药物7d。于给药后第1日用1%二硝基氟苯(dinitro-fluorobenzene, DNFB)腹部致敏,末次给药后将1%DNFB涂抹于5组实验小鼠右侧耳廓,24h后处死动物,用打孔器取相同面积两侧耳片称重,比较给药组与对照组耳廓肿胀程度。5.正常小鼠50只,随机分为5组,生理盐水对照组、阳性药物(灵芝多糖100mg/kg)组、TCBPⅡ低、中、高剂量(50,100,200mg/kg)组,给药组小鼠分别连续ip干预药物7d。给药后第2天上午,各鼠腹腔注射20%(V/V)的生理盐水兔红细胞0.2 ml进行免疫,同日下午继续给药,免疫后d6(免疫当天为d0),动物摘眼球取血,分离和收集血清用于血清溶血素水平测定。6.皮下注射环磷酰胺(CTX)复制免疫功能低下的动物模型。小鼠50只,随机分为5组,正常对照组、CTX模型组、TCBPⅡ低、中、高剂量(50,100,200mg/kg)+CTX组,采用DNFB诱导迟发型变态反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)模型,观察小鼠细胞免疫功能；碳廓清法检测单核巨噬细胞的吞噬功能；兔红细胞免疫法检测体液免疫功能。7.建立荷S180实体瘤小鼠动物模型,生理盐水对照组：每天腹腔注射(ip)无菌生理盐水0.1ml/10g体重,其他组给药体积与此相同；阳性对照组：每天ip灵芝多糖100mg/kg; TCBPⅡ低、中、高剂量组：每天分别ip TCBPⅡ50、100、200mg/kg;连续给药7d后次日上午,分离血清用于TNF-α和IFN-γ的含量测定。取血后,分离瘤体,称重,并计算抑瘤率。8.取荷S180实体瘤小鼠50只,随机分为生理盐水对照组、阳性药物(灵芝多糖100mg/kg)组、TCBPⅡ低、中、高剂量(50,100,200mg/kg)组,每组10只,腹腔注射给药,每天1次,连续7天。停药24h后,每只小鼠腹腔注射10%鸡红细胞悬液1ml,30min后,脱颈椎处死动物,检测腹腔巨噬细胞的吞噬活力。9.统计分析采用SPSS 13.0统计软件,两样本均数比较,用独立样本t检验(Independent-Sample T Test)。多个样本均数比较,经方差齐性检验后进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐时,采用LSD方法进行组间两两比较；方差不齐时,作Welch检验,再用DunnettT3方法进行组间两两比较,显著性水准取a=0.05,以P<0.05时,组间差异判断为具有统计学意义。结果：1.洗脱得三个多糖组分,分别命名为TCBPⅠ、TCBPⅡ、TCBPⅢ；TCBPⅠ含量最多,TCBPⅡ次之,TCBPⅢ最少。TCBPⅠ低、中、高浓度(50、100、200μg/ml)均无促进脾细胞代谢MTT活力作用(P=0.597,P=0.398,P=0.073),TCBPⅢ低、中浓度(50、100μg/ml)无促进脾细胞代谢MTT活力(P=0.497,P=0.398),高浓度(200μg/ml)可显著促进脾细胞代谢MTT活力(P=0.034)。因此,TCBPⅡ活性最高,用于后续研究。2. TCBPⅡ低、中、高浓度(50,100,200μg/ml)均显著促进正常小鼠脾细胞代谢MTT活力(P=0.048,P=0.001,P=0.000),促进正常小鼠脾细胞分泌细胞因子TNF-α(P=0.016, P=0.000, P=0.000),且在一定的浓度范围内具有剂量依赖趋势,但对IFN-γ、IL-2的分泌无促进作用；TCBPⅡ低、中、高浓度(50,100,200μg/ml)显著增强正常小鼠腹腔渗出细胞代谢MTT活力(P=0.004,P=0.000,P=0.000),促进腹腔渗出细胞分泌TNF-α(P=0.044, P=0.001, P=0.000); TCBPⅡ低、中、高剂量(50,100,200mg/kg)对正常小鼠DTH反应耳廓肿胀度和兔红细胞免疫所致血清溶血素水平均无影响。3. TCBPⅡ中、高剂量(100,200mg/kg)可显著提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠DTH反应耳廓肿胀度(P=0.014,P=0.006),提高免疫抑制小鼠细胞免疫功能；TCBPⅡ中、高剂量(100,200mg/kg)可显著提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠体内碳粒廓清能力(P=0.017,P=0.012),提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能；TCBPⅡ低、中、高剂量(50,100,200mg/kg)均可显著提高兔红细胞所致环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠血清溶血素水平(P=0.011,P=0.001,P=0.000),提高免疫抑制小鼠体液免疫功能。4. TCBPⅡ低、中、高剂量(50,100,200mg/kg)对小鼠S180实体瘤生长均有显著的抑制作用(P=0.000,P=0.000,P=0.000),抑瘤率分别为26.7%,32.5%,40.7%；同时,TCBPⅡ中、高剂量(100,200mg/kg)可显著提高荷S180实体瘤小鼠血清中TNF-α的水平(P=0.039,P=0.001),但对IFN-γ的水平无影响。TCBPⅡ中、高剂量(100,200mg/kg)可显著促进荷S180实体瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞(CRBC)的吞噬率(P=0.005,P=0.000)和吞噬指数(P=0.011,P=0.003)。结论：1.开口箭多糖(TCBPⅡ)是筛选的含量较多且活性最强部位。2. TCBPⅡ体外可以显著增强正常小鼠免疫细胞代谢活力,促进正常小鼠免疫细胞分泌细胞因子TNF-α,但对IFN-γ、IL-2的分泌无促进作用。TCBPⅡ整体水平上无促进正常小鼠DTH和血清溶血素抗体生成作用。3.采用环磷酰胺成功建立免疫功能低下的小鼠实验模型。4. TCBPⅡ能显著增强环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的DTH,增加校正碳粒廓清指数(α),提高吞噬活性,促进血清溶血素抗体生成,提示TCBPⅡ能够显著促进环磷酰胺诱导的免疫功能抑制小鼠的非特异性和特异性(体液免疫和细胞免疫)免疫功能。5.成功建立了荷S180实体瘤小鼠动物模型。6. TCBPⅡ能显著抑制荷S180小鼠实体瘤的生长,提高荷S180实体瘤小鼠血清中TNF-α的水平,增强其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数,提示TCBPⅡ能够显著改善荷S180实体瘤小鼠的免疫功能。7.初步证明开口箭多糖是一种良好的免疫调节剂,其免疫调节机制可能与活化或增强巨噬细胞的功能、促进TNF-α的产生或分泌有关。