高等植物细胞程序性死亡(细胞凋亡)和次生代谢产物合成积累是受细胞内部相关基因调控的复杂生理生化活动,研究表明外界刺激因子可以通过产生NO等信号分子介导细胞凋亡和促进次生代谢产物合成。Bax inhibitor-1(bi-1)是一个新型的凋亡调控基因,它可以抑制由Bax以及生物、非生物因素引起的模式植物细胞死亡。因此,为探讨NO是否依赖相同的信号途径诱发细胞死亡和次生代谢物质合成,本文通过农杆菌介导法构建雌二醇诱导型Ppbi-1(紫竹中克隆鉴定而得)基因工程飞廉细胞株,获得稳定表达的转基因细胞后,研究了Pp-bi-1基因表达对NO诱发的飞廉细胞死亡和次生代谢产物合成的影响,初步探讨了NO介导的信号转导机制。主要实验结果如下： (1)农杆菌介导的PER8-Ppbi-1质粒转化飞廉愈伤组织细胞 通过菌落PCR、回转酶切筛选出阳性的PER8-Pp-bi-1/EHA105农杆菌菌株,以1:250的菌液浓度,暗处感染飞廉愈伤组织细胞30min,共培养后以30mg/L的Hyg作为选择浓度筛选转化细胞,在12血细胞中筛选获得28个抗性细胞系。这说明,农杆菌介导的共培养转化法适用于飞廉愈伤细胞。 (2)转诱导型Ppbi-1基因飞廉细胞鉴定 对获得的28个抗性细胞系,通过80mg/L的Hyg再次筛选,得到15个抗性细胞系,进一步的PCR分子鉴定,得到11个转基因细胞系,PCR检测和Western blotting检测的结果表明,外源Ppbi-1基因已成功转入飞廉的愈伤组织细胞基因组中,并在20μmol·L-1雌二醇(Est)诱导下能够稳定表达。 (3)飞廉转基因细胞悬浮系的建立及培养条件优化 在固体培养的转Ppbi-1基因飞廉细胞中,挑选健康的愈伤细胞接种到MS液体培养基,为使转基因细胞能够更好生长,对液体培养基及培养条件进行了优化,得到最适的培养条件为：以pH 5.8的MS+1×10-5MNAA+2×10-6MBA+258/L蔗糖为培养基,培养温度25℃,摇床转速100rpm,接种量为3g/50ml培养基；以此培养条件培养细胞,能得到分散、均一且生长迅速的悬浮细胞系；测定细胞生长曲线,发现该悬浮培养细胞的生长周期为14天；细胞悬浮培养期间,定期的PCR检测,保证了转基因细胞的稳定性,避免了培养中出现的一些假阳性细胞,为进一步实验提供了可靠的实验材料。 (4)Ppbi-1基因表达对NO诱发的飞廉细胞死亡和次生代谢产物合成的影响NO是一个新型信号分子,可以诱导植物细胞死亡和促进次生代谢产物合成。本实验中,利用NO供体SNP处理处于对数生长期转基因飞廉悬浮细胞,发现在0.5mM浓度处理下细胞出现褐化死亡,NO专一性淬灭剂cPTIO和20μmol·L-1Est诱导外源基因bi-1表达均可明显抑制由0.5mM SNP引起的细胞死亡,进一步研究发现,Ppbi-1基因能抑制1mMSNP引起的细胞死亡。对0.5mM SNP和0.5mM SNP+20μM Est处理的飞廉转基因细胞培养三天后用特异性核染料sytox染色,0.5mMSNP单独处理的细胞大部分核被染色,而且细胞核出现了核凝聚、以及染色质边集等凋亡细胞的特征；提取细胞DNA电泳分析,观察到了DNA LADDER,这说明,该细胞可能已经发生凋亡,而Est诱导Ppbi-1基因表达的细胞均未出现这些凋亡特征。以0.5mMSNP、0.5mMSNP+20μMEst、0.5mM SNP+20μMEst+1mM cPTIO处理处于对数生长末期(第9天)的细胞,第12天收获细胞,测三组细胞的生物量和总黄酮含量,SNP单独处理,飞廉黄酮类次生代谢产物合成加强,Est诱导Ppbi-1基因表达,不会抑制NO对黄酮类次生产物的合成加强作用,而添加cPTIO后明显抑制该产物的合成。 实验结果表明,Ppbi-1基因可以特异性的抑制由NO介导飞廉细胞凋亡,但对NO诱发飞廉细胞次生产物的合成积累无抑制作用,由此推测,NO可能通过两种不同机制诱导飞廉细胞凋亡和促进次生代谢产物合成。