血小板是由骨髓造血组织中的巨核细胞产生的血液中的有形成分之一,其主要功能是参与生理性止血、促进凝血并维持毛细血管的完整性等。20世纪60年代以来已确证血小板有吞噬病毒、细菌和其他颗粒的功能。众所周知,以往血小板在临床治疗主要用于治疗血小板数量减少或功能异常的患者,血小板使用方式为静脉输注。然而血小板作为一种多功能细胞,不仅在血栓形成和止血中发挥作用,而且在血管发生、组织修复和炎症等过程中也扮演着重要的角色。研究发现血小板脱颗粒释放α颗粒内丰富的生长因子,包括血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、转化生长因子 β(transforming growth factor beta,TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)、内皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)等。20世纪70年代人们开展了富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)应用于创伤修复的研究。Harke等于1977年首次分离制备PRP,成功地将其用于治疗心脏外科手术患者。1993年,Hood AG等在PRP中加入凝血酶和钙离子,并将所形成凝胶状物质代替了纤维素凝胶进行研究,首次提出了血小板凝胶(Plateletgel,PG)的概念。近年来,有关血小板应用于创伤修复的研究有了更加深入与广泛的发展,涉及颌面外科、矫形外科、整形外科和美容外科等多学科,甚至在细胞培养(包括干细胞培养)、基因工程、组织工程、抗衰老、运动医学方面以及创伤修复的完美愈合中显现出独特的作用。提示了 PG具有广阔的临床应用前景。虽然PG的疗效获得了国内外学者从实验到临床的证实和充分肯定,PG对创伤修复和组织重建具有重要价值,然而,至今未能在临床上普遍推广应用,其原因在于PG应用存在诸多局限:其一,血小板的保存时间短、保存条件要求高,加上难治性伤口愈合时间长,换药频繁,须反复多次抽取全血及当即制备,病人和医生都极难坚持。其二,采集条件和制备技术、环境要求高等原因,导致临床应用难度大。其三,我国采供血机构和医院脱节,医院不能采血,更不具有单独分离血小板的设备和技术,异体血小板的来源获取困难,临床上异体PG的开发利用难以开展。其四,血小板个体差异较大,难以实现治疗用量的标准化,无法对治疗效果进行有效评价。怎样克服PG的这些缺点,实现临床的推广应用成为摆在我们面前的问题之一。而同源异体PG可以很好地克服上述缺点,不受患者自身条件的限制、方便随时应用、有利于实现质量和应用的标准化,及有利于实现对治疗效果是否有效的系统化评价。查阅文献,国外已有同源异体PG用于治疗难愈合骨伤的案例报道:SmrkeD等于2007年报道,使用人凝血酶激活的同源性异体浓缩血小板(ABO及RhD血型相合、去除白细胞、辐照)制备的PG混合自体骨松质作为移植物治疗糖尿病粉碎性骨折胫骨延迟愈合,6个月后该患者粉碎性的胫骨神奇地愈合了,骨缺损完全桥接并且能够充分负重。治疗过程中未出现副作用,也没有检测到患者体内血小板或HLA-Ⅰ类抗体,说明临床应用异体PG是可行的。经查阅国内文献,迄今为止尚未检索到有关异体PG的研究结果报道。因此,本课题对同源异体PG制备条件进行了优化,研究了同源异体PG促创伤愈合的初步临床疗效及PG上清对单核分化的影响。本研究分为四部分,兹分述如下。一、同源异体混合血小板制备条件优化伴随医疗技术和医疗设备的快速发展,肝移植、心血管大手术、肿瘤治疗等新的治疗手段广泛开展,血小板的用量快速增加,我国目前血小板应用供求失衡,血小板供应量越来越难以满足临床需求。而与此不符的是,全血中血小板的利用率不到10%,造成了巨大的资源浪费。在输血事业发达的欧美国家,由于设备条件的优势,而很多国家均常规采用全血成分分离机对采集的全血中的血小板进行分离。此外,全血制备血小板时间短,国家规定新鲜采集的全血需在6h内制备血小板,采集后超过6h的全血不再进行血小板制备,无形之中造成全血中血小板资源浪费。根据前期的研究,我们进一步优化了同源异体混合血小板制备条件,以便更大限度地利用全血中血小板资源,为临床应用提供数据支持和奠定基础。本研究借鉴国外最新的研究成果,对白膜法制备手工血小板的方法进行了探索:采集28名健康献血者400ml/人次全血,采用白膜法分离制备手工血小板,按照采集与制备时间的不同分为A组:新鲜全血采集6h之内立即进行手工血小板的分离制备(对照组);B组:新鲜全血采集6h之内进行第一步分离,白膜放置6h小时进行第二步分离;C组:新鲜全血采集6h之内进行第一步分离,白膜放置24h小时进行第二步分离;D组:新鲜全血采集6～8h之后进行手工血小板的分离制备。检测血小板计数(PLT)、血小板平均体积(MPV)、白细胞残余率、PH值、低渗休克反应(HSR)、血小板聚集率以及CD62p的变化。通过研究采集与制备时间对手工血小板质量的影响,探讨白膜法制备手工血小板的方法。我们的研究发现白膜放置6h之后(B组)制备手工血小板其血小板计数(779.9±83.8×109/L)和血小板低渗休克反应(HSR : 62.61±5.24%)高于其他三组、MPV (6.44±0.17fl)和 CD62p (47.67±7.40%)低于其他三组。B、C、D三组血小板计数、PH值、HSR和血小板聚集的比较均优于对照A组,且差异有统计学意义(P<0.05 = ,流式细胞术检测CD62p结果发现四组之间无明显差异。手工制备血小板可以打破传统6～8h之内必须制备的概念,并且摸索出血小板再浓缩离心条件为2500g×10min。二、血小板凝胶制备条件的优化目前自体PG应用于烧伤整形、心脏外科、慢性溃疡、口腔颌面外科、眼科等领域的研究虽然取得了一定进展,但由于PG制备来源的局限及缺乏统一制备及应用的标准制约了 PG的进一步推广。血小板的浓度、血小板与激活剂的比例、不同种类的激活剂等因素均可影响PG的生物学活性。国内外报道PG的制备方法和条件尚无统一、规范的标准,导致PG临床治疗效果差异。因此,本部分研究的目的是想通过比较不同条件制备的PG上清对体外生物学活性的影响,寻找最佳的PG制备条件。国内外研究发现PG上清液中的这些生长因子对多种细胞如成纤维细胞血管内皮细胞、角质形成细胞等等有明显的促进增殖作用。因此本部分研究我们选择了血管内皮细胞ECV304细胞株作为细胞模型,将PG上清与ECV304细胞共培养,通过分析和比较PG上清对细胞增殖、迁移的影响,同时测定不同方法制备的PG中VEGF的含量,来摸索和优化PG制备条件,包括血小板的浓度、血小板与激活剂的比例、不同的激活剂等。我们的实验结果证实:PG有显著促进的ECV304细胞增殖和迁移的作用。外源性凝血酶的加入缩短了 PG形成时间(P<0.05),但是不同浓度的凝血酶对PG形成时间、ECV304细胞增殖和迁移影响甚微(P>0.05)。PG促ECV304细胞增殖作用随血小板浓度的增加而增强,血小板浓度处于1500～2500×109/L时趋于稳定。PRP与激活剂的比例为10: 1最为合适。PG上清中VEGF含量随着PRP中血小板含量的增加而增加,差异有统计学意义(P<0.05),不同浓度凝血酶制备的PG上清中VEGF含量的差异无统计学意义(P>0.05)。我们因此确定临床应用的标准:采用PRP的血小板浓度(1000×109/L左右)、PRP与激活剂的混合比例为10:1,激活剂凝血酶的添加与否根据临床实际情况进行选择。本研究结果为PG制备的规范化、标准化提供重要参考,为将来PG在临床应用研究上提供了理论依据和数据支持。三、同源异体血小板凝胶促创伤愈合的临床疗效研究难愈合创面多见于糖尿病、心血管疾病、营养缺乏症、接受激素或细胞毒药物治疗等类型的患者,其中老年、合并多种疾病、长期卧床患者更为多见。造成创口长期不愈的原因是患者正常的创伤愈合功能被削弱。临床常见的治疗方法主要是换药清创、负压吸引,使用一些特殊的敷料(如高分子材料覆盖物、水凝胶敷料、人工膜片等),但是对于难愈合创面的治疗效果不甚令人满意。生长因子制品如金因肤、贝复剂等修复效果略优于上述方法,但是单一生长因子活性低、不如多重生长因子有效。临床上这类患者由于创面长期迁延不愈、需定期换药、花费极大,甚至伤口处理稍有不慎,就会带来更为严重的后果(如伤口感染、截肢、脓毒血症等),医生处理起来相当棘手,因此迫切需要一种有效的新方法来治疗难愈合创面,解决患者的病痛、提高他们的生活质量。目前临床上用于静脉输注的浓缩血小板制剂根据保存期限可以分为新鲜血小板(Fresh血小板)和冰冻血小板(Frozen血小板)。本部分研究应用新鲜血小板、冰冻血小板制备的同源异体PG (Fresh PG和Frozen PG)对临床难愈合创口进行了治疗,并对治疗效果进行了研究。44例患者随机分为三组对照组、Fresh PG组和Frozen PG组。对照组采用临床常规方法,Fresh PG组和Frozen PG组分别采用Fresh PG和Frozen PG治疗,观察并记录创面愈合情况,测量愈合面积或体积,进行统计学分析。44例难治性创面患者综合疗效评价统计结果显示,Fresh PG组和FrozenPG组治疗效果明显优于对照组,治疗第3、6、12周时的愈合率实验组明显高于对照组,差异有统计学意义。Fresh PG组和Frozen PG组比较差异无统计学意义。Fresh PG组和Frozen PG组具有疗程短、换药间隔时间长、愈合质量好等优势。提示同源异体PG用于治疗难治性创面效果明显优于常规治疗方法,无不良反应,是一种简单易行、安全有效的方法。四、血小板凝胶上清对单核细胞分化的影响炎性细胞,特别是单核细胞在创面愈合过程中发挥了重要的作用。单核/巨噬细胞是主要的炎性细胞之一。单核/巨噬细胞是机体抵御外来病原体的第一道防线,是一群具有异质性的细胞。针对不同的微环境,单核/巨噬细胞能作出不同的反应,表现出不同的活化状态,能分化成为具有不同表型和功能特征的亚群。目前根据其不同表型和功能特征可以将单核/巨噬细胞分成:M1经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophages)、M2旁路性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophages)。其中M1型巨噬细胞能产生大量炎性因子,扩大炎症反应;而M2型仅产生低剂量炎性因子,抑制炎症反应,并具有促进组织修复的能力。TNF-α、LPS、IFN-γ等可促使单核细胞向M1型巨噬细胞分化;IL-4、IL-10、IL-13等可促使单核细胞向M2型巨噬细胞分化。本部分研究中,我们以单核/巨噬细胞为靶点,采用MACS方法提取人外周血CD14+单核细胞作为研究对象,并用制备的混合人AB型PPP和PRP (包括两种PRP,血小板计数分别为500×109/L、1000×109/L)制备的凝胶上清(上清表示为PPP、PRP500*109/L、PRP1000*109/L)分别进行培养,来研究PG上清对CD14+单核细胞体外分化的影响。形态学观察发现:随着培养时间的延长,PRP刺激组细胞呈集落样生长,镜下观察多为长梭形样细胞及一些非贴壁的小圆形细胞,而PPP刺激组细胞大而圆似煎蛋样、胞浆内有丰富的颗粒细胞慢慢增多。细胞表面标志结果显示PRP500*109/L,PRP1000*109/L处理组与PPP处理组相比CD163、CD309的表达率显著增高。RT-PCR结果显示:与PPP处理组相比,PRP500*109 /L、PRP1000*109/L 处理组 IL-10 和 TGF-β mRNA 表达增高显著,iNOs及IL-12P40 mRNA的表达均降低。培养上清细胞因子检测结果发现:PRP500*109/L及PRP1000*109/L处理组TGF-β的分泌量高于PPP处理组,PPP处CCL-2的分泌量低于PPP处理组。根据结果,我们因此提出结论:PRP可能诱导Mo向M2巨噬细胞分化,并通过M2巨噬细胞在创伤修复中发挥作用,从而促进创伤愈合。此观点丰富了 PRP促进创伤修复机制的基础理论,并为PRP促进创伤修复的治疗提供了新的理论依据和新的靶点,有希望为PRP临床治疗创伤修复开了另一扇窗。其调节作用及其分子机制,有待我们进一步深入研究。