绪论:炎症性肠病(IBD)包括胃肠道所有慢性炎性疾病。由于其无法治愈的特点,以及治疗和管理的限制,成为一项重大的健康挑战,而且其发病率和流行程度在全球范围扩增趋势。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是IBD的主要亚型,它们症状相似但也表现出很精准的差异。CD具有攻击性,发病机制多样化,病变跨粘膜,并可影响整个胃肠道,即使它主要涉及小肠。症状上,CD的特征是腹部不适和疼痛、发烧和明显的血性粘液性便。UC的症状与CD相似,但以血性便为特征,并在解剖学仅局限于结肠和直肠。病人经常出现里急后重。目前,可用于治疗IBD的制剂包括氨基水杨酸盐、抗腹泻药、抗生素、皮质类固醇、免疫调节剂和生物制剂,例如抗TNF-α和抗α 4β7整合素。其他研究报道益生菌作为维持肠道完整性的潜在治疗剂,对于IBD的治疗和预防至关重要。然而,IBD的大多数治疗方案具有严重的副作用。免疫抑制剂如皮质类固醇抑制免疫功能,患者更容易感染。长期使用可导致骨质疏松而增加骨折的易感性。生物制剂与淋巴瘤的关系受到关注,而抗腹泻和抗生素可导致肠道微生物菌群失调。与当前治疗剂相关的并发症,加上不能完全治愈,亟待IBD的替代疗法。CXCL8/IL-8是最早鉴定和测序的趋化因子之一,IL-8能诱导中性粒细胞产生激活因子(NAF),刺激胞吐作用,并通过相应受体产生H202和超氧化物。IL-8结构于1991年首次阐明,它由72个氨基酸肽和3个反平行β链组成,α螺旋由C末端残基组成。其二硫键位于Cys7-Cys34和Cys9-Cys50,使蛋白质稳定。CXCL-8被归类为CXC趋化因子,Cys7和Cys9被GIn8(谷氨酰胺)分开。另外,CXCL-8以二聚体形式存在,通过氢键来稳定。尽管CXCL-8单体对CXCR1表现出更强的亲和力,但IL-8单体和二聚体都表现出对CXCR2的相似亲和力。已经确定,分别将前15个氨基酸的突变为丙氨酸影响了 GIu-Leu-Arg(ELR)基序,竞争性结合实验发现这种变化或突变导致CXCL-8对同源受体的亲和力较低,并且被认为是抗CXCL-8疗法的线索。许多细胞组成性的分泌IL-8,包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞。未受刺激的细胞或组织,未检测出IL-8。然而,在细胞或组织刺激后,其分泌升高并极易检测。它可受其他细胞因子诱导,包括IL-1、IL-6、IL-8本身,CXCL12和TNF。此外,环境压力、感染和活性氧(ROS)都可调节IL-8的活化和分泌。另外,IL-8活化由转录因子NF-k β和活化蛋白1(AP-1)介导。人重组CXCR1/2拮抗剂与IL-8结构相似,但其K11和G31突变。11位赖氨酸(K)被精氨酸(R)取代,31位的甘氨酸(G)突变为脯氨酸(P)。这种定向的点突变带来了构象和功能的改变,与CXCL-8竞争性结合CXCR1/2,从而拮抗IL-8的功能。这种新设计CXCR1/2 拮抗剂--CXCL8(3-72)K11R/G31P(缩写为 G31P)可抑制表达CXCR1/2的细胞如中性粒细胞介导的各种炎症反应。CXCL8是CXC趋化因子家族的成员之一,可将中性粒细胞募集到炎症部位。CXCL8途径的激活始于CXCL8与G蛋白偶联受体(GPCR)CXCR1(具有相对高亲和力)的结合,但与CXCR2和其他CXC趋化因子受体的亲和力较低。在先前的研究中已经强调CXCR1/2作为治疗靶标的作用,一些文章报道G31P在许多疾病中的治疗作用,包括肺炎和肿瘤,如乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌。然而,很少有研究报道了 CXCR1/2-G31P在炎性肠病中的潜在应用。赋予G31P的中性粒细胞浸润抑制特性和较少副作用,认为研究其在IBD中的效力是合适的,特别是UC。因此,本研究的目的是研究CXCL-8拮抗剂G31P对IBD的治疗作用,重点是UC。方法:所采用的技术包括体外和体内试验。体外试验包括对THP-1细胞进行功能和分子测定。应用LPS 1μg/ml诱导炎症,加或不加20μg/ml或30μg/ml G31P进行干预,CCK-8检测结果。体内实验,将8周龄、体重22-26克的28只C57/BL/6J小鼠,根据治疗随机分成4组,每组7只,分为对照组,葡聚糖硫酸钠(DSS)组,DSS+G31P 组和 DSS+G31P+嗜酸乳杆菌(DSS+G31P+LACT)组。G31P皮下注射,隔天一次,剂量0.5mg/kg体重,0.9%无菌生理盐水稀释。除DSS和G31P外,DSS+G31P+LACT组每日剂量106CFU/mL嗜酸乳杆菌于200ul生理盐水,口服强饲法。除了肉眼观察,其他研究包括CCK-8的增殖试验、transwell迁移试验、ELISA、PCR、蛋白质印迹、苏木精和伊红染色、免疫组织化学染色和流式细胞术。结果:CCK-8测定显示,在孵育48h后,G31P在浓度为20μg/ml和30 μ g/ml时对THP-1细胞增殖具有显着抑制作用;与LPS(1 μg/ml)共处理,孵育48小时后,G31P30 μ g/ml时显示出显著的抑制作用。LPS刺激使CXCR1mRNA表达略微升高,CXCR2mRNA显著增加,但两者均在G31P处理后减少。IL-8的转录和翻译水平在体外和体内均显著下调。RT-PCR检测炎性细胞因子的转录活性,结果显示:G31P以浓度依赖性方式显著下调LPS相关的IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达。然而,与对照和LPS诱导的组相比,IL-10mRNA表达保持相对不变。此外,G31P可逆转LPS诱导的炎症相关酶(包括COX-2、MMP-2和MMP-9)的升高;同时G31P限制了单核细胞衍生的巨噬细胞的迁移。为进一步探究G31P影响细胞因子的表达的机制,通过RT-PCR检测炎性相关转录因子,包括c-Fos、c-Jun、SP-1和NF-kβ。结果显示G31P明显降低c-Fos和NF-kβ的mRNA表达,但c-Jun mRNA的表达略有升高。此外,G31P可使SP-1mRNA明显增加,呈浓度依赖性。小鼠结肠炎模型体内实验显示,G31P通过改善的疾病活动指数证明对DSS诱导的结肠炎的保护作用。组织病理学检查在DSS组中确定了严重损伤,结肠完整性明显破坏,标记有被侵蚀的隐窝和杯状细胞,以及扭曲的结肠上皮结构。与DSS组对比,DSS+G31P组(p<0.001)和DSS+G31P+LACT(p<0.05)结肠状况均有改善,但G31P最佳。DSS组小鼠结肠组织TNF-α、INF-丫、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平升高,而DSS+G31P和DSS+G31P+LACT中均显着降低。与对照组相比,所有组中IL-10mRNA的表达水平没有显著差异。此外,ELISA检测血清IL-8的表达结果,尽管G31P可逆转其上调,但DSS+G31P+LACT的降低更为显著(p<0.001),表明具有协同作用。炎症的特征之一是免疫细胞向炎症部位迁移。采用RT-PCR和IHC,检测结肠组织中F4/80、CD68、IL-17A和IL-17F的表达水平。DSS+G31P和DSS+G31P+LACT组结肠中巨噬细胞的迁移明显受到抑制。DSS+G31P组IL-17A表达显着减少,而DSS+G31P+LACT组显示IL-17A表达升高。另一方面,与对照组相比,所有组中IL-17F表达略有升高。与DSS组相比,靶向CD68作为巨噬细胞标记物的免疫组织化学(IHC)染色显示治疗组中巨噬细胞的浸润显著减小。通过测定VEGF,TGF-β和明胶酶:MMP-2和MMP-9的表达水平来研究G31P对结肠纤维化的作用。与DSS组相比,DSS+G31P和DSS+G31P+LACT组VEGF和TGF-β的mRNA表达均显着降低。同样,DSS+G31P 和 DSS+G31P+LACT 组 MMP-2 和 MMP-9 的表达降低,尽管不显著;而MMP-9 mRNA,G31P+LACT组显著降低几乎等同对照组。紧密连接蛋如E-钙粘蛋白和occludin作为结肠组织完整性指标,与对照组相比,DSS组中这些蛋白质的水平显着降低,而DSS+G31P和DSS+G31P+LACT组中E-钙粘蛋白均有显著恢复,而与DSS组相比,occludin表达略有增加。免疫印迹和RT-PCR研究对AKT和ERK途径的影响。在结肠炎模型和体外研究中观到察G31P可抑制AKT1和ERK1/2的活化。该减少也抑制了下游HIF1 αi和Egr1的表达。相反,流式细胞术分析显示高浓度G31P增加LPS诱导的THP-1单核细胞的ROS水平。结论:本研究首次证明CXCL8拮抗剂G31P在体外具有有效的抗炎活性,并具有G31P和/或G31P+LACT对体内炎症性肠病的治疗能力。体外研究显示,IL-8拮抗剂G31P可抑制炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达;抑制与炎症有关的酶:COX-2、MMP2和MMP-9,并且影响炎症相关的转录因子。通过c-Fos而不是c-Jun,G31P抑制AP-1转录因子。体内研究表明,G31P阻止巨噬细胞迁移并限制其在UC中的浸润。此外,治疗方案(G31P和/或G31P+LACT)明显减轻UC相关炎症,改善结肠纤维化,并增强紧密连接蛋白。G31P,但不是G31P和LACT的组合,显着降低T细胞相关细胞因子、IL-17A表达。从机制上讲,G31P通过抑制AKT1和ERK1/2信号传导途径以及上调的ROS信号传导来发挥调节作用。