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目的:研究长链非编码RNA FAL1基因对结直肠癌细胞增殖、侵袭迁移能力及上皮间质化的影响和相关作用机制,为结直肠癌预后评估和靶向治疗提供新方向。方法:1.我们选取临床术后切除结直肠癌标本及相应癌旁组织共50组,通过实时定量PCR(RT-q PCR)技术定量分析lnc RNA FAL1在结直肠癌及癌旁组织中的表达差异情况,同时分析在正常结肠上皮细胞HCo Epi C及5种结直肠癌细胞系中lnc RNA FAL1的表达情况。将50组标本按照lnc RNA FAL1表达情况分为高表达组及低表达组,依据临床信息统计分析lnc RNA FAL1与癌组织大小、TNM分期及淋巴结转移情况等临床病例资料的相关性,并作Kaplan-Meier生存曲线分析。2.通过人工合成lnc RNA FAL1过表达及敲低质粒载体,转染结直肠癌细胞系HCT116和HT29细胞,筛选稳定的lnc RNA FAL1过表达及敲低细胞株,确认lnc RNA FAL1的过表达及敲低情况,通过MTT及细胞克隆形成实验,细胞增殖、侵袭和迁移实验观察等方法研究lnc RNA FAL1对结直肠癌细胞HCT116和HT29细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。通过RT-q PCR和western blot测定对lnc RNA FAL1上皮间质化(EMT)相关因子E-cadherin和Vimentin的表达情况的影响。3.通过Reg RNA网站预测靶定lnc RNA FAL1的mi RNA,运用双荧光素酶报告实验验证lnc RNA FAL1与mi R-637之间直接的靶向关系,运用RT-q PCR进一步验证lnc RNA FAL1及mi R-637的相互影响关系。为深入发现mi R-637在结直肠癌中的作用,运用RT-q PCR技术测定50组结直肠癌及癌旁组织标本中mi R-637表达水平,通过Pearson相关检验分析结直肠癌组织中mi R-637与lnc RNA FAL1表达量的相关性。通过合成mi R-637 mimics及ASO-mi R-637转染HCT116和HT29细胞,人为过表达及敲低这两种细胞中mi R-637的表达水平,运用MTT、细胞克隆形成实验、侵袭和迁移实验方法观察细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化,通过RT-q PCR和western blot测定EMT相关因子E-cadherin和Vimentin的表达情况。4.通过Target Scan 7.1网站预测分析mi R-637潜在下游靶基因,使用双荧光素酶报告实验检测mi R-637和NUPR1之间的直接靶向关系,运用RT-q PCR进一步验证细胞中mi R-637对NUPR1的影响。RT-q PCR和Pearson相关检验分析结直肠癌及癌旁组织标本中NUPR1 m RNA的表达水平及mi R-637与NUPR1表达量的相关性。通过人工合成载体质粒过表达或沉默NUPR1,运用MTT、克隆形成、侵袭和迁移实验分析NUPR1对HCT116和HT29细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响,RT-q PCR和western blot测定EMT相关因子E-cadherin和Vimentin的表达量。5.通过文献检索发现NUPR1与HIF-1α存在相关性,而HIF-1α与LASP1存在关联,通过RT-q PCR及western blot检测过表达或敲低NUPR1的HCT116和HT29细胞中HIF-1α与LASP1的表达水平,同时分析过表达NUPR1同时沉默HIF-1α对HCT116和HT29细胞恶性表型的影响。6.同时过表达Lnc RNA FAL1和mi R-637,观察HCT116和HT29细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化,运用RT-q PCR和western blot分析NUPR1、HIF-1α和LASP1表达水平的变化情况。结果:1.通过RT-q PCR对50组结直肠癌和癌旁组织分析发现lnc RNA FAL1在结直肠癌组织中显著高表达(P<0.01),相对于正常结肠上皮细胞Hco Epi C,HCT116、HT29、SW620、SW480和Lo Vo结直肠癌细胞系中lnc RNA FAL1的表达水平显著增高,尤其以HCT116(P<0.001)和HT29(P<0.01)细胞系中表达量最高。通过统计分析临床数据资料,发现lnc RNA FAL1表达水平与患者性别、年龄及病理类型是无关的,与肿瘤的大小、TNM分期及淋巴结转移情况有关(P<0.05)。同时,Kaplan-Meier生存曲线结果提示lnc RNA FAL1高表达的结直肠癌患者生存率显著低于lnc RNA FAL1低表达的患者(P<0.05)。2.RT-q PCR结果提示pc DNA3-lnc RNA FAL1可显著提高HCT116和HT29细胞中lnc RNA FAL1(P<0.001),psh R-lnc RNA FAL1则可高效率敲低lnc RNA FAL1(P<0.01)。MTT结果表明,HCT116和HT29细胞接种后48h,pc DNA3-lnc RNA FAL1组细胞增殖活性较对照组显著提高(P<0.05),并且随时间推移(72h、96h)增殖活性逐步增高,psh R-lnc RNA FAL1组细胞增殖活性则显著降低(P<0.05),随时间(72h、96h)持续降低。平板克隆实验结果表明过表达lnc RNA FAL1可显著增强HCT116和HT29细胞的集落形成能力(P<0.01),沉默lnc RNA FAL1则集落形成能力受到抑制(P<0.01)。侵袭和迁移实验结果揭示过载lnc RNA FAL1可显著提高HCT116和HT29细胞侵袭和迁移能力(P<0.01),下调lnc RNA FAL1侵袭和迁移细胞显著减少(P<0.01)。RT-q PCR和western blot结果表明上调lnc RNA FAL1可促进EMT进程,反之亦然(P<0.01)。3.Reg RNA网站检索结果提示lnc RNA FAL1的122-144位有mi R-637的结合位点,推测lnc RNA FAL1可能是mi R-637作用靶点。双荧光素酶报告实验结果显示,p GL/Luc-lnc RNA FAL1 WT和ASO-mi R-637共转染组荧光素酶活性明显提高(P<0.001),p GL/Luc-lnc RNA FAL1 WT和mi R-637 mimics共转染组荧光素酶活性显著降低(P<0.001),同时过表达mi R-637及敲低mi R-637会导致lnc RNA FAL1的低表达及高表达,而过表达及敲低lnc RNA FAL1会导致mi R-637的低表达及高表达,辅证两者的直接靶向关系。结直肠癌及癌旁组织RT-q PCR结果提示mi R-637在结直肠癌组织中显著低表达(P<0.01),且lnc RNA FAL1和mi R-637表达水平呈显著负相关(R=-0.44,P<0.05)。MTT实验、平板克隆实验、侵袭和迁移实验结果表明上调或下调mi R-637可导致HCT116和HT29细胞增殖能力、集落形成能力、侵袭和迁移能力下降或增强,同时引起细胞上皮间质化能力减弱或增强。4.Target Scan 7.1检索结果提示NUPR1为mi R-637潜在靶基因。双荧光素酶报告实验结果证明p GL/Luc-NUPR1 WT和mi R-637 mimics共转染组荧光素酶活性显著降低,p GL/Luc-NUPR1 WT和ASO-mi R-637共转染组荧光素酶活性则显著提高(P<0.01)。RT-q PCR结果提示mi R-637 mimics转染组细胞NUPR1 m RNA表达明显下降,反之亦然(P<0.01),辅证二者直接靶向关系。同时通过RT-q PCR结果发现NUPR1在癌组织中显著高表达(P<0.01),与mi R-637的表达水平呈负相关(R=-0.37,P<0.01)。MTT实验、平板克隆实验、侵袭和迁移实验结果表明上调或下调NUPR1可导致HCT116和HT29细胞增殖、集落形成、侵袭和迁移能力增强或减弱(P<0.001)。5.通过文献检索发现NUPR1可以影响HIF-1α的表达,而HIF-1α和LASP1的表达呈相关性,RT-q PCR结果证实敲低或上调NUPR1可有效下调或上调HIF-1α和LASP1的表达水平。沉默HIF-1α可有效逆转NUPR1对HCT116和HT29细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响(P<0.01)。6.过表达mi R-637可在一定程度上逆转lnc RNA FAL1对HCT116和HT29细胞增殖、侵袭和迁移能力的促进效应(P<0.01),RT-q PCR和western blot结果证实lnc RNA FAL1可在m RNA和蛋白水平显著上调NUPR1、HIF-1α和LASP1表达,mi R-637则可在一定程度上逆转lnc RNA FAL1的效应(P<0.001)。结论:Lnc RNA FAL1在结直肠癌中高表达,并与结直肠癌的不良预后有关。Lnc RNA FAL1在结直肠癌中发挥促癌基因效应,可能显著增强肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移、EMT的能力。Lnc RNA FAL1在结直肠癌中主要通过靶向调控mi R-637/NUPR1通路而发挥促癌基因效应,在结直肠癌的临床诊断和治疗的研究上具有一定价值。