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在长期进化过程中,豆科植物与根瘤菌建立了共生关系并导致根瘤的形成。在根瘤中,根瘤菌将大气中的氮气转化为氨供给植物,从而使植物能够在氮素匮乏的环境中正常生长。根瘤的形成是一个复杂的生物学过程,涉及到根瘤菌的侵染、植物根皮层细胞分化及根瘤的发育成熟。虽然目前对豆科植物—根瘤菌共生互作的分子机制研究取得了长足的进展,众多与结瘤相关的基因已经被鉴定,但是其中部分基因的具体功能仍然未知。Phytocyanins(PCs)为植物特异性的I型蓝铜蛋白,在植物中的生物学功能尚不完全清楚,在豆科植物根瘤形成中的作用也鲜见报道。实验室前期的研究发现,PC家族的某些成员可能参与了豆科植物共生结瘤过程。本研究首先对7个已测序豆科植物(蒺藜苜蓿、大豆、鹰嘴豆、木豆、百脉根、赤豆和菜豆)中的PC基因家族进行了全基因组鉴定和进化分析,随后以模式豆科植物蒺藜苜蓿为研究对象,鉴定出3个结瘤特异性的PC基因(MtPLC1、MtENODL27和MtENODL28),并对其中的MtPLC1在结瘤过程中的功能开展了详细研究,主要结果如下:(1)全基因组鉴定和表达分析:(i)对7个已测序的豆科植物中的PC家族基因进行全基因组鉴定和进化关系分析,结果表明在蒺藜苜蓿和大豆中PCs发生了明显扩张,且在蒺藜苜蓿中主要由串联重复事件引起;在蒺藜苜蓿中发现了82个MtPC基因,可分为4个亚家族,在进化树上可聚为7个支;表达谱分析发现,这些基因表现出不同的跨组织表达模式;(ii)时空表达分析显示,MtPLC1、MtENODL27和MtENODL28为三个结瘤特异性表达基因;共表达分析表明,与MtPLC1、MtENODL27和MtENODL28共表达的基因分为两个模块:MtENODL27和MtENODL28同在一个模块,MtPLC1则在另一个模块,说明MtPLC1在结瘤过程中所起的作用与MtENODL27和MtENODL28是有区别的。(2)MtPLC1的定位分析:(i)组织定位分析显示,在接种根中,MtPLC1首先出现在内皮层,然后向皮层过渡,并在侵染腔中表达;在根瘤中,MtPLC1主要在过渡带和固氮区表达;(ii)亚细胞定位分析:序列分析显示MtPLC1含有N端信号肽,因此首先验证其分泌性,结果显示在35S启动子的驱动下,MtPLC1定位于烟草叶片细胞和蒺藜苜蓿根细胞内,并未分泌到胞外。在自身启动子的驱动下,根瘤内的免疫荧光定位显示MtPLC1定位在过渡带和固氮区的类菌体周膜;进一步分离成熟根瘤的共生体,对目的蛋白进行免疫印迹,结果显示目的蛋白的确存在于共生体上。(3)MtPLC1的RNAi分析:(i)统计侵染事件,结果显示与对照组相比,在干扰植物中,微菌落、延伸侵染线、皮层侵染线和根瘤原基的数目明显减少;检测与侵染相关基因的转录水平,结果显示干扰后DIM1和DIM2的表达没有明显变化,而DIM3、NSP1、NSP2、ERN1、ERN2、ERN3、ENOD11和NIN则明显下调,推测目的基因可能位于钙峰的下游,影响根瘤菌的侵染;统计植物的生长及生理指标,结果显示在接菌后第28 d,干扰组植株的株高、根长、叶绿素含量、根瘤数目、固氮酶活和豆血红蛋白转录水平均明显降低,说明MtPLC1干扰后抑制了植物结瘤和固氮,不利于植物生长;(ii)观察根瘤内部结构,发现在接菌后第10 d,RNAi根瘤细胞中存在大量侵染线,表明根瘤菌释放被抑制;在14 d的RNAi根瘤中,几个类菌体被类似于膜的结构所包裹,呈现出降解的迹象;在28 d的RNAi根瘤中,固氮区的根瘤细胞轮廓变得不规整,边缘畸形,细胞内已经不存在类菌体或者类菌体的形态不正常,形成了类似于“鬼膜”的结构,说明MtPLC1的沉默导致根瘤早衰;(iii)检测28 d根瘤内类菌体的细胞色素氧化酶活性,结果显示MtPLC1干扰后细胞色素氧化酶的活性较对照组明显降低,说明MtPLC1的下调可能影响了类菌体的能量代谢和固氮环境;(iv)测定不同时期与活性氧相关的指标,结果显示在接菌第15d,干扰根瘤中过氧化氢和超氧阴离子的含量相较于对照组显著上升;同时,在根瘤发育过程中,也观察到RNAi根瘤中超氧阴离子的累积明显多于对照组;此外,在接菌第15 d的RNAi根瘤中,羟基自由基清除能力和超氧化物歧化酶活性较对照组均明显上升,然而总的抗氧化能力却显著低于对照组,说明MtPLC1的干扰影响了ROS的稳态,而植物自身的清除能力并不能显著地削弱ROS的累积;(v)RNA-seq分析结果显示,MtPLC1被沉默后,共生根中差异表达的基因主要与根瘤形态发育、氧化还原、转录调控、蛋白磷酸化等过程相关;同时,qRT-PCR验证了部分与类菌体分化、ROS生成和抗氧化等相关基因的表达水平,结果与RNA-seq数据一致,说明MtPLC1基因干扰后影响了根瘤内氧化还原的稳态。(4)MtPLC1的过表达分析:(i)对侵染过程进行观察,发现过表达植物中延伸侵染线和皮层侵染线的数目较对照组明显上升,表明过表达MtPLC1可以促进根瘤菌的侵染;表型及生理指标统计分析显示,接菌后第45 d,过表达植物中叶绿素含量、株高、根长、根瘤数目、固氮酶活和豆血红蛋白的转录水平与对照组相比均明显上升,说明MtPLC1过表达后有利于根瘤形成并提升其固氮能力,进而促进植物生长;(ii)观察根瘤内部的结构,发现在接菌后第45 d,对照组已经出现衰老区,而过表达根瘤仍存在大面积的固氮区,说明MtPLC1过表达后延缓了根瘤衰老。综上,本研究对豆科植物PC家族成员进行了全基因组鉴定和进化分析,明确了其在蒺藜苜蓿中的系统发育特征,并鉴定出几个结瘤特异性表达基因;通过对其中的MtPLC1基因进行组织与亚细胞定位、基因沉默及过表达分析,证实其对根瘤菌侵染、类菌体分化及根瘤发育必不可少;进一步的机制分析显示,该基因可能通过影响共生过程ROS的稳态进而参与根瘤形成的调控。上述结果为深入阐明PC家族基因在豆科植物—根瘤菌共生互作中的功能奠定了基础,并为明确该家族基因在植物中的生物学功能提供了借鉴。