L-高丝氨酸发酵及提取工艺研究

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L-高丝氨酸又名L-2-氨基-4-羟基丁酸,是一种天然非蛋白氨基酸,其在代谢途径中是蛋氨酸与苏氨酸的共同前体;L-高丝氨酸及其衍生物在医药、化工、农业等多个领域具有极大的开发价值和应用前景。本文对L-高丝氨酸在发酵液中的检测方法、发酵工艺、提取工艺进行了研究,主要研究结果如下:(1)建立优化了利用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生高效液相色谱检测发酵液中L-高丝氨酸的方法。测定了L-高丝氨酸-3MPA-OPA衍生物最大吸收峰为337 nm;通过优化流动相洗脱梯度,提高了L-高丝氨酸与其结构类似物苏氨酸的分离度,分离度R=1.613,分离度良好;验证了该方法的精密度,多次测量后得到峰面积计算相对标准偏差(RSD)为:0.424%(n=6),同时计算了该方法的平均加标回收率为98.3%,证明仪器方法精密度良好(n=5);验证了该方法的稳定性,其24 h内不同时间响应数值之间的RSD=1.75%符合稳定性需求;同时通过在流动相中添加四氢呋喃与三乙胺优化了色谱峰型;通过线性关系考察得到拟合曲线Y=1.8784986E6X+22527,R~2=0.9996,证明该方法在1 mg/L至4g/L范围内线性关系良好,同时计算检测限与检出限可得:LOD=0.851 mg/L;LOQ=0.193 mg/L。(2)优化了E.coli HM4(p BRmet L–rht A23)菌产L-高丝氨酸的培养基成份,改进了了补料分批发酵过程的补料程序及溶氧调控。在250 m L普通摇瓶发酵中,通过在单因素试验确定了最适碳源葡萄糖及其最适浓度40 g/L、最适氮源酵母粉及其最适浓度5 g/L、最适(NH4)2SO4浓度10 g/L、最适Mg SO4浓度4 g/L及Ca CO3添加量15 g/L;通过Plackett-Burman因素筛选试验对L-高丝氨酸产量影响最为显著的三个因素为葡萄糖浓度、酵母粉浓度及(NH4)2SO4浓度;利用响应面分析(RSM)的方法优化确定了250 m L摇瓶中L-高丝氨酸响应值的最高点为5.21 g/L,与之对应的葡萄糖浓度为40.8 g/L、酵母粉浓度为4.2 g/L、(NH4)2SO4 12.2 g/L,验证试验证明响应面模型可靠;确定了发酵培养基成份为:每升含:葡萄糖40.8 g、酵母粉4.2 g、(NH4)2SO4 12.2 g、Mg SO4·7H2O 4 g、KH2PO4 4 g、L-赖氨酸0.164 g、L-苏氨酸0.238 g、微量元素母液5 m L、Ca CO315 g。在20 L发酵罐分批补料发酵过程中,通过控制葡萄糖浓度、提高罐压,最终使L-高丝氨酸44 h积累量达到52.82 g/L,对比初始培养基成份及发酵条件所得产量提高了54%。(3)探究了活性炭脱色L-高丝氨酸发酵液、离子交换树脂法提取L-高丝氨酸的可能性。确定了最佳活性炭脱色条件为自然p H、脱色时间10 min、活性炭添加量1%;通过静态吸附试验确定了最佳进样液p H为4.5~6.0,同时测定了732(001×7)树脂对L-高丝氨酸的静态吸附平衡曲线;在使用732树脂进行提取的过程中,确定了进样液的最适流速为1.5 m L/min,选取了氨水作为洗脱剂,确定了洗脱剂的最适流速1.5 m L/min;最终检测并计算了经过活性炭脱色、离子交换树脂提取后L-高丝氨酸的单次提取总收率为33.1%,样品纯度为71%。本论文通过对发酵液L-高丝氨酸在发酵液中的定量检测方法、发酵工艺优化以及提取工艺的探究,为L-高丝氨酸的发酵生产及其后续的大规模生产提供了参考。
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