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第一部分PD患者及细胞模型中维生素D及PARP1的水平目的:分析帕金森病（PD）患者及健康对照者血浆中维生素D水平和PARP1的表达的差异;MPP+细胞模型中维生素D受体和PARP1的表达,parthanatos死亡的激活情况。方法:收集PD患者及健康对照者的血浆,通过ELISA检测分析各组血浆中25-羟基维生素D水平,使用Western blot检测PARP1及cleaved-PARP1的表达。使用MPP+处理SH-SY5Y细胞,CCK-8法验证MPP+的毒性,随后使用Western blot检测VDR、PAR、PARP1和AIF的表达水平。在MPP+处理前,使用不同浓度Z-VAD-FMK和Nec-1预处理SH-SY5Y细胞,CCK-8法检测细胞活性变化,验证MPP+诱导的细胞死亡类型。结果:ELISA结果显示PD患者血浆25-羟基维生素D水平较健康对照组相比明显降低,Western blot结果显示PD患者PARP1及cleaved-PARP1（89k D,40k D,25k D）表达增多。在SH-SY5Y细胞中随着MPP+处理浓度逐渐升高,SH-SY5Y的细胞活性逐渐降低,Western blot结果显示随着MPP+处理浓度逐渐升高,VDR表达逐渐减少,同时PARP1、PAR逐渐激活,AIF在细胞核定位增多,以100μM的MPP+处理最为明显。Z-VAD-FMK和Nec-1的预处理不能改变由MPP+引起的细胞活性降低。结论:帕金森病患者血浆维生素D水平降低、PARP1激活,MPP+细胞模型中VDR表达减少,PARP1信号途径激活,发生parthanatos死亡。第二部分Calcitriol减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞parthanatos死亡目的:观察calcitriol在减轻MPP+诱导SH-SY5Y细胞parthanatos死亡中的作用。方法:CCK-8法确定calcitriol干预MPP+细胞模型的浓度,将细胞模型分为Control组、Calcitriol组、MPP+组和Calcitriol+MPP+组,通过流式细胞检测各组细胞内ROS和Ca2+水平,使用试剂盒检测各组NAD+的水平,Western blot检测各组PAR、PARP1、p-H2A.X、AIF、VDR的表达,通过TUNEL染色检测、PAR和AIF的免疫荧光染色进一步验证Western blot的结果。结果:25、50、75n M的calcitriol预处理能够部分恢复由MPP+引起的细胞活性降低,其中以50n M的calcitriol作用最为明显,此浓度也被选作calcitriol的细胞干预浓度。流式细胞检测显示MPP+组细胞内ROS和Ca2+的水平明显升高,calcitriol预处理降低了细胞内ROS和Ca2+的水平。MPP+组NAD+的水平明显下降,反映了NAD+的过度消耗,calcitriol预处理减轻了NAD+的消耗。Western blot显示MPP+组PAR、PARP1、p-H2A.X表达增加,与MPP+组比较,这些指标在Calcitriol+MPP+组表达减少,calcitriol能够上调VDR的表达。TUNEL染色显示MPP+组断裂DNA增多,Calcitriol+MPP+组与MPP+组相比TUNEL染色阳性细胞数减少。免疫荧光染色验证了Western blot中PAR、AIF表达的结果,显示AIF在MPP+处理后在细胞核定位增加,Calcitriol+MPP+组的AIF在细胞核定位明显减少。结论:Calcitriol预处理能够改善由MPP+引起的细胞活性降低,降低细胞内ROS和Ca2+的水平,减轻parthanatos死亡。第三部分Calcitriol减轻MPTP亚急性PD小鼠模型中的parthanatos死亡目的:观察calcitriol在减轻MPTP亚急性PD小鼠模型中parthanatos死亡的作用。方法:将C57/BL6小鼠随机分为4组,每组数量10只,MPTP组按30mg/kg腹腔注射MPTP 7天;Calcitriol+MPTP组在MPTP给药前7天开始腹腔注射calcitriol（2.5μg/kg）并持续21天,中间7天重叠给药;Calcitriol组腹腔注射calcitriol 21天,Control组注射空白溶剂对照21天。药物干预完成后,进行行为学测试（转棒实验和爬杆实验）检测小鼠的运动功能。提取小鼠黑质和纹状体部位的蛋白进行Western blot检测TH的表达情况,对小鼠黑质和纹状体部位的脑片进行免疫组化和免疫荧光染色验证其TH表达情况。提取小鼠黑质和纹状体部位的蛋白进行Western blot检测PAR、PARP1、cleaved-PARP1、p-H2A.X、VDR的表达,使用小鼠黑质和纹状体部位的脑片进行TUNEL染色,使用小鼠黑质部位的脑片进行cleaved-PARP1免疫组化染色,VDR、PAR和AIF的免疫荧光染色。结果:MPTP组小鼠转棒实验的潜伏时间明显缩短,爬杆时间明显延长,calcitriol改善了MPTP引起的运动障碍。Western blot结果显示MPTP组小鼠黑质和纹状体TH表达明显降低,Calcitriol+MPTP组TH表达较MPTP组明显升高,黑质和纹状体的免疫组化和免疫荧光TH染色也有相同的结果。MPTP组小鼠黑质和纹状体蛋白的Western blot结果显示,MPTP组与Calcitriol+MPTP组及Control组相比VDR表达水平明显降低,PAR、PARP1、cleaved-PARP1和p-H2A.X表达明显增高。MPTP组与Calcitriol+MPTP组及Control组相比小鼠黑质和纹状体TUNEL阳性细胞数明显增多。MPTP组与Calcitriol+MPTP组及Control组相比小鼠黑质cleaved-PARP1免疫组化染色和PAR免疫荧光染色结果与Western blot结果一致,AIF染色显示MPTP组小鼠存在明显的细胞核定位增加,calcitriol减少了AIF的细胞核积累。结论:Calcitriol改善了由MPTP引起的运动障碍,减轻了多巴胺能神经元受损以及parthanatos死亡。第四部分Calcitriol对PARP1的作用机制研究目的:研究calcitriol对PARP1的抑制作用机制。方法:通过质粒直接上调SH-SY5Y细胞中VDR的表达,验证calcitriol的保护作用是否通过VDR实现。在基因水平上调和下调VDR,观察PARP1表达的变化。转染si RNA-VDR敲低VDR的表达,对照组转染阴性对照si RNA,使用real-time PCR和Western blot检测VDR、PARP1的m RNA和蛋白表达水平。通过转染VDR质粒过表达VDR,对照组转染阴性对照质粒,real-time PCR和Western blot用于检测VDR、PARP1的m RNA和蛋白表达水平。使用免疫共沉淀法检测VDR与PARP1是否有直接结合,使用小鼠黑质部位切片进行VDR和PARP1的免疫荧光染色,观察VDR与PARP1是否存在共定位。结果:基因水平直接上调VDR可以减轻由MPP+导致的PARP1激活,与使用calcitriol预处理MPP+细胞模型一致,显示calcitriol的作用通过VDR实现。VDR m RNA水平明显降低验证了si RNA-VDR的敲低效率,同时敲低VDR使PARP1 m RNA的表达增加,Western blot检测显示出一致的结果。过表达VDR质粒下调了PARP1 m RNA的表达,Western blot显示VDR过表达质粒组较对照组VDR明显增高,PARP1的表达减少。免疫共沉淀结果显示VDR与PARP1有着直接结合,免疫荧光染色显示VDR与PARP1存在共定位。结论:Calcitriol的保护作用通过VDR直接与PARP1结合并调节PARP1的表达实现。