前言过敏性休克(anaphylactic shock)属于速发型变态反应,是IgE介导的Ⅰ型变态反应中最为危重与急骤的一种。过敏性休克可以出现皮肤、呼吸系统、消化系统以及心血管系统的症状和体征,严重者可以导致患者死亡,经常引起医疗纠纷和民事诉讼。过敏性休克死亡尸体常无特异性病理学改变,其法医学诊断也缺乏明确的客观指标。过敏性休克的发生是由于肥大细胞脱颗粒所释放的各种介质发挥其作用生物学所致。类胰蛋白酶(tryptase)和胃促胰酶(chymase)是肥大细胞中两种中性丝氨酸蛋白酶,其分子量大于其他致过敏性反应的介质,且其理化性质稳定,因此,类胰蛋白酶和胃促胰酶被认为是肥大细胞脱颗粒的重要标志。白细胞介素5(interleukin-5,IL-5)是嗜酸性粒细胞(Eosinophil,EOS)趋化因子之一,是Ⅰ型变态反应中主要的效应因子。组织中IL-5的表达主要限于哮喘的研究,而关于过敏性休克发生后IL-5在体内的表达情况,尚缺乏深入的研究。本研究在建立豚鼠过敏性休克的动物模型基础上,应用免疫组织化学技术,观察人混合血清致豚鼠过敏性休克死亡体内多脏器组织中类胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5的表达情况,通过病理学观察和统计学分析,并结合《医疗事故处理条例》所规定的保存条件,来评定这三种介质在过敏性休克诊断中的意义,为过敏性休克死亡的法医学鉴定提供形态学依据和指标。材料和方法一、动物模型的建立及分组健康成年豚鼠24只,随机分为死亡即时组、冷藏48小时组和冷冻7天组,每组8只,每组又分实验组和对照组,每组4只。实验组应用人混合血清诱发豚鼠发生过敏性休克死亡;对照组豚鼠采用生理盐水代替血清,乙醚麻醉过量致死,提攘阶殡嗍笮难票秆灞讣?取喉头、气管、双肺、胃等器官,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。准备明确过敏性休克死亡和非过敏性休克死亡实际案例各5例进行初步探索性观察研究。二、实验方法1、应用HE染色法观察组织的形态学特点;2、采用铬变素2R染色法观察组织中嗜酸性粒细胞浸润情况;3、使用化学发光法检测血清中IgE水平;4、应用免疫组织化学染色法观察类胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5在组织中的表达情况;5、使用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统计算免疫组织化学染色阳性细胞数及表达面积;6、应用SPSS统计学软件对实验数据进行统计分析。实验结果1、HE染色见过敏性休克的豚鼠喉头、气管等器官水肿,肺泡扩张,肺泡壁变薄;2、铬变素2R染色后见实验组各脏器组织内较多嗜酸性粒细胞浸润3、实验组血清IgE水平明显高于对照组,P＜0.01;4、对照组各组可见散在类胰蛋白酶和胃促胰酶免疫组织化学染色阳性的肥大细胞,细胞形态完整,染色产物分布于细胞胞浆内,呈棕黄色。实验组类胰蛋白酶和胃促胰酶染色阳性细胞增多,表达增强,而且染色产物部分弥散到肥大细胞周围及组织间隙;对照组可见散在IL-5阳性细胞,染色产物位于胞浆内。实验组IL-5阳性细胞形态不完整,染色产物大部分弥散到细胞周围和组织间隙。使用Motic Image Advanced 3.2图像分析系统计算各组免疫组织化学阳性染色面积,通过SPSS软件统计分析,发现实验组和对照组在相同保存条件下仍然存在较大差异。5、实际案例中非过敏性休克死亡者类胰蛋白酶和胃促胰酶免疫组织化学染色阳性颗粒出现于肥大细胞胞浆内,肥大细胞形态完整;过敏性休克死亡者大部分免疫组织化学染色产物弥散至肥大细胞周围和组织间隙,肥大细胞形态不规则。讨论过敏性休克是临床上常见的一种速发型变态反应,主要是由IgE介导,为Ⅰ型变态反应中最为危重与急骤的一种,常可导致患者猝死,因此,在法医学鉴定工作中经常接触到。过敏性休克的发生是由于个体在接受变应原刺激后,产生IgE类抗体,当相应的抗原再次进入机体时通过与致敏肥大细胞表面的两个或两个以上相邻IgE抗体特异结合,使膜表面的FcεRI(FC受体)交联活化,最终导致肥大细胞脱颗粒,从而引发过敏性休克的各种临床征象。过敏性休克死亡者,心血中IgE的浓度往往增高,组织中嗜酸性粒细胞数量增多。但IgE受外界因素影响较大,嗜酸性粒细胞也不是过敏性休克所特有,缺乏一定的客观性。过敏性休克发生的一个重要机制是肥大细胞脱颗粒,释放介质引起相应的症状和体征。如何证明肥大细胞脱颗粒是诊断过敏性休克的关键问题。类胰蛋白酶和胃促胰酶是肥大细胞内两种重要的丝氨酸蛋白酶,同时它们的性质非常稳定,肥大细胞发生脱颗粒时它们也会随之脱出到细胞外和组织间隙中。IL-5是嗜酸性粒细胞趋化因子,在嗜酸性粒细胞增多的疾病中,其表达将会增强。本实验通过对实验组和对照组不同保存条件下类胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5进行免疫组织化学染色观察,证实了这3种介质在过敏的豚鼠体内表达增强,类胰蛋白酶和胃促胰酶也明显地反映出肥大细胞脱颗粒现象。因此,类胰蛋白酶、胃促胰酶和IL-5的免疫组织化学染色可以为过敏性休克的诊断提供新的形态学依据。本实验将所使用的类胰蛋白酶和胃促胰酶免疫组织化学染色法应用于实际案例中,结果表明非过敏性休克死亡的标本两种蛋白酶表达的情况反映出肥大细胞的数量和形态,而过敏性休克死亡的标本内两种酶表达增强,染色产物脱出于肥大细胞外及周围组织间隙,肥大细胞形态不规则,因此,类胰蛋白酶和胃促胰酶的免疫组织化学染色法有望应用于过敏性休克的法医学实际案例的诊断。结论1、HE染色见过敏性休克的豚鼠喉头、气管等器官水肿,肺泡扩张,肺泡壁变薄;2、过敏性休克的豚鼠脏器经过铬变素2R染色后,各脏器内出现了明显的嗜酸性粒细胞浸润情况;3、过敏性休克豚鼠血清IgE水平明显高于对照组;4、过敏性休克的豚鼠体内类胰蛋白酶、胃促胰酶及IL-5的表达增强,可以为过敏性休克的诊断提供形态学依据;5、按国务院颁布的《医疗事故处理条例》实施细则规定的死亡后冷藏48小时或冷冻7天内进行尸检的条件标准,在以上两种条件下进行这三种介质的免疫组织化学染色,不影响它们的表达以及对其结果的判定;6、本实验类胰蛋白酶和胃促胰酶免疫组织化学染色方法有望应用于实际案例中,并可为实际案例提供可靠的诊断依据。