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新疆沙冬青源于第三纪,为亚洲中部荒漠地区唯一的常绿阔叶灌木,已被列为国家二级濒危保护植物。四季常绿,非常抗寒和耐旱,能耐-30℃以下的低温,是我国特种植物化学成分(如抗冻蛋白AFP)研究、提取和转接的珍贵材料。
实验利用反转录PCR(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)策略,克隆获得新疆沙冬青AFP基因开放阅读框(ORF)全长序列。所得结论如下:
1.以新疆沙冬青幼苗为研究材料,利用RT-PCR为基础克隆手段,结合RACE策略得到新疆沙冬青AFP基因的ORF。此序列全长为609bp,编码203个氨基酸。同源性分析结果表明,该ORF与其同属的蒙古沙冬青AFP基因序列同源性为65.7%,其编码的蛋白质氨基酸序列同源性为76.68%。
2.利用新疆沙冬青幼苗的基因组DNA,设计扩增AFP基因的ORF引物,所获片段的测序结果与利用其cDNA为模板获得的ORF序列完全一致,说明新疆沙冬青AFP基因无内含子,其基因是连续的。同时也说明该基因在植物进化过程中高度保守,可以作为研究植物进化历程的一个分子标尺。
3.利用相关分子生物学软件对新疆沙冬青AFP的二级结构进行分析,结果表明AFP中存在许多无规则卷曲,占72.9%,同时β-折叠结构的比例(19.21%)明显高于α-螺旋(7.88%)。说明这些无规则卷曲与β-折叠可能与该蛋白的抗冻性能有关。