【摘 要】
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体细胞转基因技术广泛的应用于基因功能研究和转基因动物育种过程中。转基因过程是一个多步骤过程,任何阶段的效率低下都会引起基因转移系统效率降低甚至导致外源基因不能表达。因此,需要采取策略来促进外源基因透过细胞膜,通过细胞质迁移到细胞核并转运通过核膜,从而能有效地表达。微管蛋白乙酰化是一种微管常规修饰,参与多种细胞功能的调节,包括纤毛组装,细胞内运输,细胞运动,以及轴突生长。SIRT2是一种微管蛋白去乙
【基金项目】
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抗病转基因牛新品种培育（2016ZX08007-003）；
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体细胞转基因技术广泛的应用于基因功能研究和转基因动物育种过程中。转基因过程是一个多步骤过程,任何阶段的效率低下都会引起基因转移系统效率降低甚至导致外源基因不能表达。因此,需要采取策略来促进外源基因透过细胞膜,通过细胞质迁移到细胞核并转运通过核膜,从而能有效地表达。微管蛋白乙酰化是一种微管常规修饰,参与多种细胞功能的调节,包括纤毛组装,细胞内运输,细胞运动,以及轴突生长。SIRT2是一种微管蛋白去乙酰化酶,主要分布在细胞质中,在体外能够对多种靶蛋白进行去乙酰化作用,在许多衰老相关疾病,如癌症、神经性疾病、糖尿病、关节炎等具有重要的调节作用,但是SIRT2对外源基因转染效率的影响并不清楚。因此,本研究利用RNA干扰、定量PCR、蛋白免疫印迹等分析手段,对SIRT2影响牛体细胞转基因效率及作用机制进行调查研究。具体结果如下:1.本研究发现,利用SIRT2特异性siRNA转染细胞后,在SIRT2沉默大约80%时,实验组与对照组相比获得了更多EGFP阳性细胞和更高的EGFP相对表达水平,这一结果表明通过干扰SIRT2表达可以提高外源基因表达水平。2.为了研究SIRT2抑制对基因转染效率的影响机制,本研究构建了SIRT2表达载体pEGFP-SIRT2,并利用蛋白印迹技术分析细胞内微管乙酰化水平。研究结果发现,与阴性对照组相比,SIRT2过表达导致微管乙酰化水平降低（pEGFP-SIRT2）,而SIRT2抑制组（SiRNA-2）的乙酰化水平则明显升高。同时,在质粒pEGFP-SIRT2转染BFFs 24 h后,利用荧光显微镜检测融合蛋白SIRT2-EGFP表达情况,结果显示SIRT2与微管共定位。而且,利用SIRT2特异性抑制siRNA（SiRNA-2）转染BFFs-EGFP细胞时发现,SIRT2抑制组与对照组相比EGFP表达未出现显著变化,由此说明SIRT2抑制并没有改变细胞核中已存在质粒DNA转录效率。同时,本研究还对转基因体细胞克隆胚胎的发育能力进行了评估。结果显示SIRT2敲除对SCNT克隆胚胎的卵裂率、囊胚率等发育能力没有产生明显影响。3.本研究通过将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因引入牛骨髓来源巨噬细胞（bBMMs）中建立了牛巨噬细胞系（TERT-bBMMs）,该细胞系表达巨噬细胞表面抗原（CD11b,CD282）。在细菌侵袭过程中bBMMs和TERT-bBMMs细胞因子表达情况发生变化,IL-1β,IL-6,IL-10,IL-12,TNF-α的表达出现了上调。这些结果表明,TERT-bBMMs细胞系能够和bBMMs细胞一样对BCG感染作出反应,能够作为体外研究牛结核病（BTB）感染机制的潜在工具。综上所述,通过干扰SIRT2的表达可以提高外源基因表达水平。这种表达的增加并不是因为质粒DNA在细胞核中转录效率的提高,而是由于SIRT2抑制使得微管乙酰化水平增加,促进了质粒从细胞质转运到细胞核的过程,进而增加了外源基因的表达水平,提高了其转染效率。TERT-bBMMs细胞系保留了bBMMs的形态和功能特征,该细胞系可以作为研究牛巨噬细胞与结核分枝杆菌之间相互作用的细胞模型。
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